曹雄杰，汪辉，周鹏，崔晓娇，胡晓博，王朝霞

国家农副产品质量监督检验中心（湖南）长沙酒类分中心，长沙市食品药品检验所（长沙 410016）

2-丙酰吡咯（CAS号：1073-26-3）是一种白色固体，微溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂，可以在很低的浓度下增加总体牛肉的香味，包括增加红肉，血和动物的气息[1]，已经被美国香料和天然提取物制造者协会（FEMA）批准为“一般认为安全”，作为香料用于食品。世界卫生组织和联合国粮农组织联合食品添加剂专家组（JECFA）对2-丙酰吡咯做出评价：按现有的摄入水平，该物质作为香料使用没有安全问题[1]，一般可按生产需要适量使用。2017年10月20日，国家卫生计生委发布 《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、食品添加剂环己基氨基磺酸钠（又名甜蜜素）等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告》，允许2-丙酰吡咯配制成食品用香精用于各类食品（GB 2760—2014表B.1食品类别除外），用量为按生产需要适量使用[2]。由于食品生产者对新允许的添加剂2-丙酰吡咯了解不够，以及对标准GB 2760—2014理解不透彻，可能会超范围使用。因此，建立食品中2-丙酰吡咯的检测方法不仅可为食品监管提供技术保障，同时也能促进食品安全健康发展。

2-丙酰吡咯作为一种新允许使用的食品添加剂，目前国内还没有关于食品中2-丙酰吡咯含量的检测方法。食品中香精含量的常用检测方法有高效液相色谱法[3-4]、液相色谱-串联质谱法[5]、气相色谱法[6]、气相色谱-质谱法[7-10]等。高效液相色谱仪为实验室常用仪器，以其高效、高灵敏度、经济的特点而被广泛运用于食品添加剂含量检测。根据2-丙酰吡咯的物理特性和化学性质，通过优化色谱条件和提取溶剂，建立了食品中2-丙酰吡咯的高效液相色谱测定方法。该方法前处理简单、快速，定量准确，干扰少，适用于大米粉、发酵乳、食用菌和矿泉水中2-丙酰吡咯的测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型液相色谱系统，包括G1329B型自动进样器、G1311C型四元泵、G1316A型柱温箱，G1315D型二极管阵列检测器（美国安捷伦科技有限公司）；KQ 5200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；X1R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）。

2-丙酰吡咯（≥99.0%，HPLC级，Alfa Aesar公司）；甲醇（≥99.9%，色谱纯，德国Merck KGaA公司）；乙酸铵（≥98. 0%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水为 Millipore Intergral 3超纯水仪制备的超纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取50 mg 2-丙酰吡咯标准物质，加少量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，并以甲醇定容至刻度，配制成浓度为1.0 g/L标准储备液。分别移取0.2，0.4，1.0，2.0，10.0和20.0 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，加甲醇定容摇匀，配制成2.0，4.0，10.0，20.0，100.0和200.0 mg/L的标准系列工作溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温，40 ℃；流动相，甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（冰乙酸调pH 3）（40∶60，体积比），等度洗脱；检测波长，285 nm；进样体积，10 μL。

1.4 样品处理

准确称取2.0 g（精确至0.1 mg）固体样品于50 mL离心管中，加入30 mL水-甲醇（20∶80，体积比）混合溶剂，超声提取30 min，以5 000 r/min离心3 min后，取上清液过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱分析。

准确移取8 mL液体样品于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，超声提取30 min，转入50 mL离心管中，以5 000 r/min离心3 min后，取上清液过0.45 μm滤膜后供高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 不同流动相条件下光谱图

使用10 mg/L的标准溶液，分别以甲醇、甲醇-水（40∶60，体积比）、甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（40∶60，体积比）、甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（冰乙酸调pH 5.0）（40∶60，体积比）以及甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（冰乙酸调pH 3.0）（40∶60，体积比）为流动相，不经过色谱柱直接进入检测器，二极管阵列检测器在210～400 nm之间进行扫描，扫描结果如图1所示。结果显示：五者在285 nm波长处均有最大吸收，前两者光谱峰基本一致，后者由于高体积分数乙酸在低波长有强吸收，导致目标物在低波长处出现负值，但最大吸收峰与前两者基本一致。因此，选择285 nm作为该方法的检测波长，同时在实际测定过程中根据选择的流动相对应光谱图定性。

图1 2-丙酰吡咯紫外扫描图谱

2.2 流动相选择

2-丙酰吡咯为中等极性化合物，有弱酸性，试验采用Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对目标物进行分离。分别考察了不同体积比（80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60和30∶70）甲醇-水作为流动相对保留时间和峰型的影响。结果表明：有机相比例越小保留时间越长，且峰逐渐展宽，响应也随之变低，当体积比为30∶70时，目标峰的保留时间已经超过20 min，色谱图见图2。考虑到保留时间在10 min内会有其他物质干扰，超过20 min会影响分析效率，且消耗大量试剂，不符合绿色环保经济的理念，最终选择比例为甲醇-水（40∶60，体积比）。

图2 不同流动相比例下2-丙酰吡咯色谱图

在流动相中加入适当浓度的盐可以改善峰型，流动相中加入0.02 mol/L乙酸铵后，保留时间变小，峰高增高，峰型变得更加尖锐。同时考察了甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（40∶60）在不同pH（6.8，5.0和3.0）条件下对保留时间和峰型的影响。由结果可知：随着流动相pH降低，保留时间逐渐减少，峰高逐渐升高，当pH 3.0时，响应值最高，可获得最低的检出限，且保留时间满足试验要求，谱图如图3所示。最终确定使用流动相甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（乙酸调pH 3）（40∶60，体积比），见图4。

图3 流动相pH对色谱图的影响

图4 含2-丙酰吡咯酸奶色谱图

2.3 溶剂提取效率

考察了水、甲醇、乙腈三种不同溶剂对大米粉、发酵乳、食用菌三种基质中待测组分的提取率，准确称取2.0 g（精确至0.1 mg）样品，各3组，分别加入水、甲醇、乙腈摇匀，超声提取30 min，以5 000 r/min离心5 min后，取上清液供高效液相色谱分析。结果如表1所示。

表1 不同溶剂对色谱图信号指标的影响（n=3）

采用水和甲醇提取样品，2-丙酰吡咯有较好的峰高和信噪比。考虑到标准品在水中溶解度较差，最终选用溶剂水-甲醇（80∶20，体积比）作为提取溶剂。

2.4 检出限、定量限及线性关系

在优化的试验条件下，以不同样品空白基质加标溶液进行检出限和定量限考察。以信噪比S/N分别为3和10确定2-丙酰吡咯在各种样品中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果显示：固体样品检出限为9.0 mg/kg，定量限为30.0 mg/kg。矿泉水中检出限为4.5 mg/kg，定量限15.0 mg/kg。配制成质量浓度分别为2.0，4.0，10.0，20.0，100.0和200.0 mg/L的标准溶液，采用高效液相色谱分析，以质量浓度（x，mg/L）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：2-丙酰吡咯回归方程为y=73.3x-7.8，相关系数（r）为0.999 99，在2.0～200.0 mg/L浓度范围内表现出了良好的线性关系。

2.5 回收率和相对标准偏差

分别在大米粉、发酵乳、食用菌中添加30.0，60.0和300.0 mg/kg以及在矿泉水添加1.25，2.50和12.5 mg/kg三个浓度水平的标准溶液进行加标回收率测定，其回收率结果如表2所示。不同加标浓度下2-丙酰吡咯的加标回收率在91.0%～109.0%之间，相对标准偏差（RSD）在0.18%～2.56%之间，均在标准规定的范围内[11]，说明该方法有良好的准确度和精密度。

表2 2-丙酰吡咯的回收率和相对标准偏差（n=6）

2.6 干扰试验

考察了质量浓度均为10 mg/L食品中常见食品添加剂（甜味剂糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、纽甜以及营养强化剂维生素A、维生素D2、维生素D3、维生素E）在试验色谱条件下对待测组分的干扰。结果显示，此条件下以上10种食品添加剂对2-丙酰吡咯的测定均无干扰。

3 结论

方法通过选择提取溶剂水-甲醇（80∶20，体积比）提取食品中的2-丙酰吡咯，使用流动相甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（冰乙酸调pH 3）（40∶60，体积比），以Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离，采用二极管阵列检测器检测2-丙酰吡咯，外标法定量，得到快速测定食品中2-丙酰吡咯的高效液相色谱方法。该方法的方法学验证参数均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求[11]，具有良好的准确度、精密度且操作简单，同时只需要采用少量对环境污染小的有机溶剂，符合绿色环保的环境理念。