李素云，覃颖泉，谢冬梅，张华，李星科，王语迟

郑州轻工业大学食品与生物工程学院（郑州 450002）

冷冻面团技术是应用在面食制品生产的新工艺，因其不仅能延长面食制品的贮藏时间，还能提高面食制品制作的方便和贮藏稳定性，所以发展迅速。但冷冻后的面食制品会出现一定程度的品质变化，这是因为在冷冻过程中，酵母菌细胞内外水分冻结成冰，冰晶生长会破坏酵母细胞膜结构，同时酵母胞内水分变化会发生电解质浓缩效应，影响细胞的生理功能和代谢功能，直接对酵母菌造成机械伤害[1-2]，从而导致冷冻后馒头体积变小、醒发时间延长等问题，这严重制约冷冻面团制品发展[3-4]。因此，对于酵母细胞耐冻性增强和活性保护成为冷冻面团研究的主要问题[5]。

前期研究表明，在相同酶解时间内，超声辅助酶解的大米多肽（RP）培养基中得到的酵母细胞量比未超声培养基中得到的酵母细胞量多，证明大米多肽可以促进酵母细胞增殖，且与多肽分子量大小有关。因此试验以葡萄糖作为碳源，在酵母培养基中用超声辅助酶解制取的大米多肽、酪蛋白胨及酵母氮源作为氮源进行比较，进一步研究大米多肽对酵母增殖、发酵活性及耐冻性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

大米多肽（RP，制备具体参数为：超声功率密度51.8 W/L、超声温度50 ℃、超声时间15 min；大米蛋白溶液浓度40 g/L，酶添加量[E]/[S]=6%，溶液温度50 ℃、pH 8.5，酶解100 min后灭酶、上清液冻干）；酪蛋白胨；酵母氮源；葡萄糖（分析纯）；安琪干酵母；酵母浸粉；蛋白胨；琼脂粉。

1.2 主要仪器与设备

离心机；低温冰箱；可见/紫外分光光度计；立式压力蒸汽灭菌器；超净工作台；生化培养箱；恒温振荡器。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基及培养条件的确定

YNB培养基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB（酵母氮源基础）、pH 5.5；大米多肽培养基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L RP（大米多肽）、pH 5.5；25 g/L CP培养基：20 g/L葡萄糖、25 g/L CP（酪蛋白胨）、pH 5.5；YPD培养基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固体培养基加20 g/L琼脂粉）。YNB培养基用0.22 μm滤膜过滤除菌，其他培养基121 ℃、15 min高温高压灭菌；酵母细胞培养在100 mL培养基中，安琪酵母经2代活化后以1%接种量接菌于培养基，于30 ℃、120 r/min培养24 h。

1.3.2 酵母细胞的收集及湿质量测定

将培养24 h后的菌液分装到提前称质量并记录好质量（m1，g）的50 mL离心管，使用离心机离心得到酵母细胞。离心条件为：转速4 000 r/min、离心时间10 min。离心后菌液下层沉淀即为所需的酵母细胞，舍去上清液，称定离心管质量（m2，g），m2与m1的差即为所得酵母细胞的湿质量。

1.3.3 发酵面团制备、发酵过程测定及蒸制

将离心后得到的酵母细胞与42 g去离子水、75 g面粉混合成面团，每份50 g于100 mL相同规格的小烧杯中压平表面，一份于37 ℃直接发酵，另一份置于-18℃低温冰箱储存5 d，取出常温解冻1 h后37 ℃发酵。面团发酵过程中每隔15 min用直尺测面团高度并记录，发酵结束后，将发酵面团于沸水入锅蒸20 min，结束5 min后开锅取出放凉，从中间切开观察剖面。

1.3.4 生长曲线的测定

为了解不同氮源培养基对酵母增殖的影响，将经2代活化后的酵母菌液以1%接种量接菌于100 mL培养基中，在30 ℃下以120 r/min摇床培养。分别在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，27，30，33和36 h时取样，用可见/紫外分光光度计测定菌液吸光度，测定波长600 nm。以生长时间为横坐标，菌液吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3.5 酵母细胞存活率的测定

培养结束后用稀释涂布平板法对所得菌液进行平板培养计数，同时将菌液置于-18 ℃低温冰箱储存5 d，取出解冻1 h后用同样的方法进行平板培养计数，得到冷冻前后培养液中酵母细胞浓度，计算存活率。

存活率=lg（冷冻后培养液中酵母细胞浓度）/lg（未冷冻时培养液中酵母细胞浓度）×100% （1）

2 结果与分析

2.1 不同氮源培养基对酵母细胞增殖的影响

由前期研究可知，培养基中添加25 g/L大米多肽可以获得较好的培养效果。因此以25 g/L氮源浓度研究其对酵母细胞增殖影响，所以试验培养基浓度均为25 g/L。表1为不同氮源培养基培养酵母细胞离心后得到的酵母细胞湿质量。由表1可知，大米培养基离心后得到的酵母细胞最多，有1.35 g；其次是CP培养基，离心出1.26 g酵母细胞；最后是YNB培养基和空白对照组。从表1的数据可证明大米多肽对于酵母细胞的增殖有促进作用。

表1 不同氮源培养基中得到的酵母湿质量

2.2 不同氮源培养基培养酵母的生长曲线

以25 g/L氮源浓度研究其对酵母细胞培养过程的影响，OD600nm值的大小和菌液中的细胞密度呈正比，具体结果见图1。结果表明，CP作为氮源的培养基在0～5 h和其他氮源培养基内的酵母数量差别不大，但是于10～24 h菌液的OD600nm值增加比YNB、CP的快，且酵母的对数期时间较长。因此大米多肽作为氮源培养基最终得到更多酵母细胞，证明大米多肽能促进酵母细胞增殖。

图1 不同氮源培养基中酵母细胞的生长曲线

2.3 大米多肽培养基对面团中酵母细胞发酵活性的影响

在相同大小的烧杯中，通过测量面团的发酵高度的增长表示面团中酵母细胞的发酵力。图2为3种不同氮源的培养基所得酵母发酵面团高度。

由图2可知，与CP和YNB培养基中所得酵母细胞发酵的面团能力相比，RP培养基中所得酵母细胞发酵的面团最先达到发酵终点，约120 min，且此时面团增长高度约是YNB面团的1.02倍、CP面团的1.7倍，表明以大米多肽作为培养基氮源培养酵母细胞在面团中具有更好发酵力。

对于冷冻面团，由图2可以看出，大米多肽培养基面团能更快进入发酵状态，发酵力保持仍然很好，210 min时大米多肽培养基面团增长高度约是YNB培养基面团的2.9倍，是CP培养基面团的9.6倍。因此大米多肽培养得到的酵母细胞在冷冻后的发酵面团中也能够较好地保持发酵力。

图2 不同氮源培养所得酵母发酵面团高度

图3 是不同时间面团发酵的照片记录，可看到60 min时各个面团的发酵程度相差比较明显，未冷冻的发酵面团随发酵的进行高度差距逐渐减小，而以大米多肽作为培养基培养的酵母添加到面团冷冻后发酵高度始终明显高于其他两种面团。结合图2，冷冻后面团发酵过程中的高度变化表明，冷冻后大米多肽培养基培养的酵母细胞在面团中能够保持较高的发酵力，用大米多肽作为培养基氮源培养酵母细胞在面团冷冻过程中发酵力的损失较少。发酵结束面团蒸制后切面照片如图4所示。对于未经冷冻的面团蒸制的馒头，大米多肽培养基馒头内部气孔细密均匀；CP培养基、YNB培养基和空白组馒头内部气孔相较之下不够均匀，存在较多大气孔。对于面团冷冻5 d后蒸制的馒头，大米多肽馒头内部气孔与未经冻藏相比变化较小，但CP、YNB培养基和空白组馒头内部气孔都变小很多，表示相应发酵力很小。

2.4 发酵面团中添加大米多肽方式对酵母细胞发酵活性的影响

大米多肽作为培养基氮源来培养酵母细胞添加在普通面团和冷冻面团中均有显著效果，将大米多肽直接添加到面团中进行发酵，发酵面团的高度变化曲线如图5所示。大米多肽直接添加到面粉里进行发酵，在初始阶段发酵力比大米蛋白作为培养基的效果要好，但是120 min后大米蛋白作为培养基的效果要好于直接添加到面粉里的，同时冷冻后的面团具有相同趋势。原因有可能是多肽作为培养基氮源培养得到更多酵母细胞，同时这些酵母细胞还具有更好的耐冻性，研究结果与Izawa等[6]相同。

图3 冷冻和未冷冻面团在不同发酵时间的照片记录（从左到右为RP，CP，YNB）

图4 发酵结束蒸制后的照片记录

图5 发酵面团中添加大米多肽方式对酵母细胞发酵活性的影响

2.5 不同氮源培养对酵母细胞耐冻性的影响

为探究大米多肽对酵母细胞耐冻性的影响，不同培养基中酵母细胞冷冻前后的细胞存活率如图6所示。RP培养基里的酵母存活率最高，YNB次之，CP培养基里的酵母存活率最低。大米多肽培养基培养的酵母细胞冷冻后存活率明显高于CP培养基培养的酵母细胞，比CP培养基里的酵母细胞存活率高约34.58%，表明大米多肽对增强酵母细胞的耐冻性有一定影响，可减少冷冻导致的细胞失活。

图6 冷冻前后不同培养基中的酵母细胞存活率

3 结果与讨论

用不同的培养基培养酵母细胞对酵母细胞的增殖、发酵活力及耐冻性有不同影响。由试验可得到如下结论：

1) 大米多肽对于酵母细胞的增殖有促进作用。大米多肽、CP和YNB这3种培养基中，大米多肽培养基培养的酵母细胞增殖最多。

2) 与酵母氮源及酪蛋白胨相比，以大米多肽作为氮源的培养基培养酵母，在普通发酵面团及冷冻发酵面团中具有更好的发酵力。

3) 在面团中直接添加大米多肽对普通发酵面团及冷冻发酵面团都没有显著的效果，因此大米多肽对于酵母细胞增殖影响主要作用在酵母细胞的培养过程而不是发酵过程。

大米多肽在酵母细胞的培养过程中，促进酵母细胞的增殖，使酵母细胞的耐冻性增强，改善了冷冻面团的发酵性能。大米多肽作为一种本身可食用的功能性营养物质应用于培养基，与基因手段等方法相比更加简便高效且安全，应用于酵母细胞制备和冷冻面团中也更容易被消费者所接受，能扩大大米多肽的应用范围。