赵慧玲，王佳燕，吕慧，张立华

枣庄学院食品科学与制药工程学院（枣庄 277160）

桑树（Morus alba L.）为桑科桑属落叶乔木，在世界上现存10～14种[1]。我国种植桑树的历史悠久，桑园面积达80.5万 km2[2]，被誉为最大的桑树种植国。桑树为特种经济树种，用途广泛，叶可饲蚕，桑椹为食药同源的果实[3]。桑叶除用于养蚕外，还是传统的中药，被称为“铁扇子”“神仙草”[4]，具有抗敏、防痉挛、凉血明目等功效[5]，用于治疗伤风感冒、咽喉肿疼等症。现代研究表明桑叶中含有黄酮、多糖、多酚、1-脱氧野尻霉素（DNJ）活性物质[6]，具有降血糖、降血压、抗衰老等作用。且近代研究发现DNJ是桑叶降血糖作用的主要功能成分[7-8]。给糖代谢障碍患者服用富含DNJ的桑叶提取物12周，能够控制患者餐后血糖的升高[9-10]。桑提取物还能够改善d-半乳糖诱导的衰老小鼠认知障碍，有利于抑制衰老进程[11]。

有人分析了不同品种和产地的桑叶总黄酮、总酚、粗多糖及γ-氨基丁酸的含量，结果显示有较大的差异[12-13]；不同季节的桑叶中活性成分也存在差异[14-15]。环境温度影响桑叶干物质的积累，32 ℃的环境温度有利于桑叶干物质积累[16]。而有关不同干燥方式对桑叶活性成分和抗氧化活性的影响鲜见报道，试验比较分析自然晾干、冻干、烘干及发酵后烘干这4种不同方式干燥桑叶的活性成分及抗氧化活性，为桑叶资源更有效的利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑叶（2018年10月采自枣庄市市中区的九龙山，经专家鉴定为鲁桑品种的桑树叶片）；乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸标准品（天津博迪化工股份有限公司）；DNJ、DPPH和芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

DHG-9053A电热恒温干燥箱（扬州鸿都电子有限公司）；LYO-0.5真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司）；TDL-40B低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；FA1104B精密电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；薄层色谱仪（上海科哲生化科技有限公司）；紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶样品的处理

采摘的新鲜桑叶分别进行以下处理：自然晾干，在室温条件下晾晒至干燥；冻干，使用真空冷冻干燥机在-15 ℃下冷冻直至干燥；烘干，使用鼓风干燥箱在65 ℃下烘干；发酵后烘干，先使用茶叶揉捻机揉捻处理至汁液渗出，参考红茶加工工艺中的发酵处理方法[17]在室温下发酵8 h，之后使用鼓风干燥箱在65 ℃下烘干。

将这4种不同方式干燥的桑叶样品使用微型中药粉碎机分别粉碎处理，过60目筛，备用。

1.2.2 桑叶水分含量测定

利用快速水分测定仪对鲜桑叶及4种干桑叶样品进行水分含量测定，所得数据绘制成图。

1.2.3 桑叶中多酚、黄酮的含量测定。

1.2.3.1 多酚、黄酮提取液的制备

采用醇提法[18]提取黄酮和多酚类化合物。分别称取1.00 g 4种样品桑叶粉，新鲜桑叶也称取1.00 g使用研钵研碎，在30 mL 80%的乙醇、70 ℃条件下水浴浸提2 h，提取液在4 000 r/min转速下离心10 min，上清液即为多酚和黄酮粗提取液。

1.2.3.2 多酚的含量测定

采用Folin-Denis试剂法[19]测定多酚含量，以没食子酸对照品溶液（0.02 mg/mL）绘制标准曲线，计算多酚含量，测定时分别取0.50 mL桑叶粗提液，用蒸馏水稀释至8 mL，得到桑叶稀释液A，先后加入福林试剂、桑叶稀释液A、水和20%的Na2CO3溶液至反应终体积6 mL，空白不加样品，振荡后静置30 min，在750 nm处测定吸光度。

1.2.3.3 黄酮的含量测定

采用AlCl3法[20]测定黄酮含量，以芦丁对照品溶液（0.21 mg/mL）绘制标准曲线，计算黄酮含量，测定时分别取2 mL桑叶粗提液用蒸馏水稀释到15 mL，得到桑叶稀释液B，先后加入桑叶稀释液B、乙醇、NaNO2溶液，振荡后静置5 min，然后加入Al(NO3)3溶液振荡后静置6 min，最后加入NaOH溶液并用乙醇溶液补至终体积10 mL，振荡后静置10 min，在510 nm处测定吸光度。

1.2.4 DNJ含量测定

分别称取20.00 g 4种样品桑叶粉、20.00 g新鲜桑叶，使用研钵研碎，加入100 mL 70%乙醇，在超声波清洗机中超声辅助提取40 min，提取液在4 000 r/min转速下离心10 min，置旋转蒸发仪浓缩至10 mL，得到脱氧野尻霉素粗提取液。

将4种桑叶提取液过滤，定量点样，置于由正丁醇-冰乙酸-水（体积比4∶1∶1）组成的展开体系中展开，以茚三酮为染液进行染色，然后取出，在波长334 nm处进行扫描，得到图谱，并对其积分求含量。以DNJ标准品制作工作曲线。

1.2.5 清除DPPH自由基能力的测定

在20 mL试管中依次加入DPPH标准液、超纯水和样品溶液至反应终体积5 mL，样品空白以无水乙醇代替药品，以抗坏血酸为阳性对照，在黑暗条件下反应30 min，并在517 nm处测定光吸光度[21]。

1.2.6 数据统计与分析

各试验至少重复3次以上，试验数据用Excel进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 不同方式干燥桑叶样品中水分含量

4种干燥方式获得的桑叶及新鲜样品中水分含量结果见图1。同批新鲜桑叶样品水分含量为64.20%，自然晾干、冻干、烘干和发酵后烘干样品含水量分别为5.98%，7.46%，5.95%和5.69%。其中冻干样品含水量相对较高，比最低的发酵后烘干高出1.75%，其他三者差别不明显。

图1 不同桑叶样品中水分含量

2.2 不同方式干燥桑叶中多酚含量比较

4种处理的样品及新鲜桑叶中多酚含量见图2。其含量差异显著（p＜0.005），晾干样品含量最高达到18.40 mg·g-1，冻干处理样品最低仅有2.96 mg·g-1，烘干及发酵后烘干分别为6.03和8.67 mg·g-1，新鲜桑叶中多酚含量为1.11 mg·g-1。因新鲜桑叶含水量高（64.20%），换算成无水材料，多酚含量约为3.24 mg·g-1，与冻干样品的多酚含量基本一致。分析认为自然晾干处理是在室温环境下缓慢失水干燥，在较长时间内叶肉细胞是有生命的，而且处于一种胁迫状态，仍会发生复杂的代谢活动，一些中间产物可能会转化成酚类物质，从而会使酚类物质显著增加；冻干过程温度较低，采摘后的桑叶细胞虽然是有生命的，但各种代谢受到抑制，物质变化也受到抑制，即桑叶中酚类物质没有较大变化；烘干是在65 ℃高温环境下进行的，桑叶细胞很快被杀死，之后代谢活动也会停止，酚类物质变化也较小；发酵后烘干处理有晾青和揉捻的过程，在此过程中会发生一系列物质的转化，包括酚类物质增加，但随后的烘干会使各种代谢活动终止，所以该种处理中多酚含量相对较高些。

图2 不同桑叶样品中多酚含量

2.3 不同方式干燥桑叶中黄酮含量比较

黄酮类化合物常以游离苷原或与糖结合的苷类等形式存在于植物中[22]。4种处理的桑叶样品中黄酮含量差异显著，结果见图3。冻干处理样品中含量最低仅有30.86 mg·g-1，发酵后烘干样品中最高达到70.13 mg·g-1，烘干及自然晾干分别为54.82和57.21 mg·g-1。新鲜桑叶黄酮含量为11.73 mg·g-1，去除高含水量的影响，折算为无水材料，约为32.76 mg·g-1，与冻干样品基本一致。冻干样品中黄酮含量较低，其原因可能与上述对多酚的分析是相同的。发酵后烘干样品黄酮含量最高，该处理有晾青和揉捻的过程，可能会使黄酮类物质增加，微生物参与的发酵活动也可能会增加黄酮含量；此外，桑叶经过揉捻，细胞结构被充分破坏，在提取时有利于黄酮的溶出，使得所测黄酮含量较高。

2.4 不同方式干燥桑叶中DNJ含量比较

1-脱氧野尻霉素（DNJ）是一种多羟基生物碱，最初是从链霉菌中提取并氢化得到，后又从桑的根皮中分离得到[23]，研究发现野柘草、风信子等植物和芽孢杆菌等微生物中也含有DNJ[24]。经测定几种桑叶样品中DNJ含量如图4所示，鲜桑叶含量最低0.64 mg·g-1，自然晾干、冻干和烘干样品分别为1.72，1.80和1.83 mg·g-1，三者相差甚微，如去除鲜桑叶中水分的影响，其中DNJ含量与该三者也基本相当。发酵后烘干样品的DNJ含量最高，可达2.30 mg·g-1，比前3种处理平均值提高了27.22%。在处理方式上，其他4种样品缺少发酵环节，因此判断在发酵过程中一系列酶促反应和微生物活动促进了DNJ的增加。肖红等[25]研究发现30 ℃发酵6 h的桑叶茶中DNJ含量增加了7.10%，也认为发酵能够提高桑叶中DNJ含量。

图3 不同桑叶样品中黄酮含量

图4 不同桑叶样品中DNJ含量

2.5 不同方式干燥桑叶清除DPPH自由基能力

各桑叶样品粗提液对DPPH自由基的清除能力大小如图5所示。各样品之间清除率差异显著，鲜桑叶的清除力最低仅20.76%，烘干样品为40.54%，冻干及发酵后烘干分别为57.99%和71.73%，晾干样品最高达到86.40%。考虑到鲜桑叶含水量高的因素，其清除DPPH自由基的能力与冻干样品是基本相当的。粗提液中含有多酚、黄酮、DNJ及其它化学成分，它们都可能是清除自由基的贡献者，一般认为桑叶中多酚的清除自由基能力最强[26]，自然晾干处理下多酚含量最高（18.4 mg·g-1），故晾干处理样品对DPPH清除作用强；烘干处理因短期内干燥、温度高，可能对桑叶中其他热敏性抗氧化活性成分造成破坏，使其清除能力较低；发酵后烘干样品黄酮和DNJ含量最高，多酚含量较高（8.67 mg·g-1），综合作用的结果，使得发酵处理的样品清除DPPH自由基的能力仅次于晾干的样品。

图5 不同桑叶样品对DPPH自由基的清除能力

3 讨论与结论

经测定4个处理及鲜桑叶的含水量，鲜桑叶含64.20%的水分，自然晾干、烘干和发酵后烘干样品含水量基本一致，分别为5.98%，5.95%和5.69%，冻干样品含水量较高一些，为7.46%，冻干样品高出其他3个处理平均值1.58%。对多酚、黄酮、DNJ的含量和DPPH清除能力的分析有一定影响，在具体的分析判断时考虑其影响因素。

冻干条件温度低，避免了各类成分的破坏，最大限度地保留了桑叶中的原有物质含量，此次结果显示冻干样品中多酚、黄酮、DNJ的含量与鲜叶样品除去水分的因素后的数据基本一致，说明冻干的确最大限度保留了鲜叶样品的物质含量。4种处理中，冻干样品的多酚、黄酮含量最低，其他3种处理都有不同程度提高，说明在采摘之后多酚和黄酮类物质还在变化着，晾晒、加热及微生物发酵等条件会提高二者的含量。如前所述，DNJ是桑叶降血糖的主要功能成分，并发现对α-葡萄糖苷酶的活性有一定的竞争性抑制作用[11]，因此DNJ的研究成为了一个热点，桑叶中DNJ含量因不同产地[12]、不同桑树品种[13]及不同生长季节[14]会有不同，此次结果显示发酵处理的桑叶DNJ含量提高了27.22%，肖红等[25]的研究也得到了一致的结果，至于发酵能提高DNJ含量的机制尚不清楚，有待进一步研究。

冻干处理除了能最大限度保留桑叶中原有物质含量，对物质活性保护也是有利的。虽然4个处理中多酚、黄酮类物质含量最低，但对DPPH自由基清除能力却高于烘干的样品，可能是低温条件下较好地保留了多酚、黄酮之外其他类型抗氧化物质。而烘干在较高温度下破坏了一些热敏性的抗氧化物质。

综上所述，不同干燥处理方式会影响桑叶中多酚、黄酮和DNJ的含量及抗氧化活性。其中，自然晾干有利于提高多酚的含量及抗氧化活性，发酵后烘干有利于提高DNJ和黄酮物质的含量，生产中应根据不同的目的选择适宜的加工方式。