李伟民，陈九杰，魏泉增，张莹丽

许昌学院食品与生物工程学院，河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室（许昌 461000）

紫花苜蓿在中国各地均有种植[1]。苜蓿（Medicago sativa）中蛋白质含量可达22%以上，含有的氨基酸种类多样[2]。大多数直接提取的叶蛋白很难被直接利用，而且苜蓿蛋白具有很强的抗原性，表现为较低的消化率和生物效价[3]，这使得苜蓿蛋白产业的发展受到一定阻碍。

苜蓿蛋白经过酶法水解后制备的多肽对人体具有重要作用，多肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质，对于预防心脑血管疾病、促进造血功能、调节内分泌与神经系统等[4]方面疾病，多肽类药物具有明显效果[5]。多肽不仅可提高物质的利用价值，还可赋予物质一定生物学活性，特别是在增强抑菌性[6]、免疫性[7]和抗氧化性[8]等方面。已发现的多肽主要有降血压、促进免疫功能、抑菌等[9]多种功能。

近年来，多肽的制备多选用核桃[10]、海参[11]、鱼籽[12]等原料，而这些原材料通常价格昂贵，不易获取。试验采用苜蓿为原材料，苜蓿易获得，经济价值低，种质资源丰富。目前对苜蓿多肽的制备方法的研究较少。试验利用中性蛋白酶对苜蓿进行酶解制备多肽，以提高苜蓿的利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫花苜蓿；中性蛋白酶（酶活力20万 U/g，南宁庞博生物工程有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2014B分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；TG16-WS离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；T6课件分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Dk-8D水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；PHS-3C型pH计（上海佑科仪器仪表有限公司）；DL-1型电炉（中兴伟业仪器有限公司）；750t型粉碎机（鹤壁市天冠仪器仪表有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 多肽溶液制备方法

准确称取一定量的苜蓿粉于反应容器中，依照蛋白酶添加量加入中性蛋白酶溶液，调整到预设pH，缓慢搅拌，酶解过程中注意维持酶解系统pH恒定。酶解结束后将酶液迅速置于沸水中灭酶10 min。冷却至室温后，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液。

1.3.2 标准曲线绘制

溶液中多肽含量测定方法采用双缩脲法[13]。标准曲线制备方式见表1。在试管中加入一定酪蛋白溶液，其中不足1 mL的用蒸馏水补至1 mL，以1.0 mL蒸馏水为空白，向各试管中加入4 mL双缩脲试剂，充分混匀，室温下反应30 min，用721分光光度计在540 nm处测其吸光度，绘制标准曲线。

表1 蛋白标准曲线制备

1.3.3 多肽浓度测定

将收集到的上清液定容至100 mL，摇匀，移取10 mL溶液至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，使上清液澄清，吸取1 mL上清液，并和4 mL双缩脲试剂混合，以蒸馏水为空白，室温下溶液反应30 min，测定吸光度。最后根据标准曲线关系式，计算溶液浓度。

1.3.4 单因素试验

确定中性蛋白酶添加量（1 500，2 250，3 000，3 750和4 500 U/g）、酶解温度（40，45，50，55和60℃）、酶解时间（2，3，4，5和6 h）和酶解pH（pH 5，6，7，8和9 h）4个因素，分别考察其对溶液中多肽含量的影响。

1.3.5 响应面试验

在单因素试验结果探索最适酶解时间、最适酶解pH、最适酶解温度、最适中性蛋白添加量的基础上，选取其中的酶解时间、酶解pH、酶解温度作响应面综合分析。采用Design-Expert 8.0.6软件中心组合试验进行多肽含量提取最佳工艺。试验方案见表2。

表2 试验因素和水平

1.4 数据分析

响应面试验结果利用Design-Expert 8.0.6软件进行分析，建立回归方程并作等高线和三维曲面图，对任意2种因素的交互效应进行分析和评价，得到最优工艺组合。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白标准曲线

以酪蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线，从而得到回归方程：y=0.043 5x+0.000 9，相关系数R2=0.999 9。

图1 蛋白标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 中性蛋白酶添加量对酶解效果的影响

中性蛋白酶添加量对酶解效果的影响如图2所示。苜蓿在中性蛋白酶添加量1 500 U/g时，多肽含量最低，随着中性蛋白酶添加量增加，水解度不断增大。中性蛋白酶添加量3 750 U/g时，多肽含量最高，随着中性蛋白酶量继续增加，多肽含量降低。酶浓度过高，酶分子间可能相互水解，导致酶解效果下降[14]。

图2 中性蛋白酶添加量对苜蓿多肽含量的影响

2.2.2 酶解温度对酶解效果的影响

酶解温度对酶解效果的影响如图3所示，溶液中多肽含量呈现先缓慢上升后逐渐下降趋势。温度40 ℃时，苜蓿多肽含量较低。在一定范围内，溶液中多肽含量与酶解温度呈正相关。温度达到50 ℃时，苜蓿多肽含量最高，随后继续增大温度，多肽含量开始下降，温度达到60 ℃时，苜蓿多肽含量最低，温度偏高或偏低均会抑制中性蛋白酶的活性，温度过高会导致中性蛋白酶逐渐失活，影响酶解效果，酶解温度以50℃为宜。

2.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

酶解时间对酶解效果的影响如图4所示。苜蓿在酶解2 h条件下多肽含量最低，随着时间增加，苜蓿多肽含量随之增加。苜蓿在酶解时间4 h时多肽含量最大。随着酶解时间继续增加，苜蓿多肽含量下降，水浴时间6 h时，苜蓿多肽含量最低，这可能是由于随着酶解时间延长，短链的多肽片段被继续水解为氨基酸[15]。酶解最适时间以4 h为宜。

图3 酶解温度对苜蓿多肽含量的影响

图4 酶解时间对苜蓿多肽含量的影响

2.2.4 酶解pH对酶解效果的影响

酶解pH对酶解效果的影响如图5所示。苜蓿在pH 5条件下多肽含量最小。在一定范围内，酶解pH与苜蓿多肽含量呈正相关。苜蓿多肽在酶解pH 7时多肽含量为最大值，随着pH逐渐增大，苜蓿多肽含量开始下降。苜蓿在酶解pH 9条件下多肽含量最低。酶解最适pH为7。

图5 酶解pH对苜蓿多肽含量的影响

2.3 响应面法优化

2.3.1 响应面法试验分析及结果

由4个单因素结果选取其中的酶解时间（A）、酶解pH（B）、酶解温度（C）这3个因素作为参考依据，以多肽含量为指标。进行响应面试验，确定中性蛋白酶水解制备苜蓿多肽的最佳工艺条件。响应面试验方案及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果

2.3.2 方差分析

通过Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，建立多元二次响应面回归模型为：R=6.78-0.043-0.010B-0.20C-0.17AB+0.25AC+0.012BC-0.65A2-0.51B2-0.39C2。由表4可以看出，模型达到极显著（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05），表明方程无失拟性因素存在，回归模型与实际值能较好地拟合。一次项A表现为显著，B、C表现为极显著，二次项A2、B2、C2表现为极显著，说明它们对响应值影响极大。由F检验可以得到影响因素主次排序：酶解温度（C）、酶解pH（B）和酶解时间（C）。

表4 回归分析结果

图6直观反映不同两因素之间的交互作用对多肽含量的影响，曲面越弯曲，两因素交互作用对多肽含量的影响越显著。由表4可知，其中因素AB、AC对多肽含量的影响显著（p＜0.01），BC对多肽含量的影响不显著（p＞0.05）。

图6 不同两因素之间交互作用对酶解液中多肽含量的影响

2.3.3 苜蓿蛋白酶解工艺的确定及优化工艺条件验证

经Box-Behnken试验设计，Design-Export 8.0.6软件分析得出最优条件：酶解pH 6.88、时间4.10 h、温度49.94 ℃。此条件下酶解液中多肽含量为6.778 8 mg/mL。将工艺参数调整为：酶解时间4.1 h、温度49.9 ℃、pH 6.88。在此工艺条件下测定的多肽含量为6.752 1 mg/mL。与预测值的相对误差0.39%，比较接近。试验可证明模型可靠，方程能较真实反映各因素对多肽含量影响的实际情况。

3 结论

试验为利用中国苜蓿蛋白资源、提高苜蓿附加值，在单因素基础上，进行响应面试验对苜蓿蛋白酶解工艺进行优化，苜蓿多肽制备的最优条件为：加酶量3 750 U/g、酶解pH 6.88、酶解温度49.9 ℃、酶解时间4.1 h。在此条件下，测得溶液中多肽的含量最高，达到6.752 1 mg/mL，与预测值两者之间的相对误差为0.39%，通过软件建造的模型也能真实直观反映情况，模型与实际情况贴近吻合，响应面的数据处理真实有效，具有实际使用价值，为苜蓿进一步开发利用提供理论依据。