复合酶法提取革胡子鲶下脚料中的磷脂酰胆碱的工艺

2020-08-25刘雪凌林贝周学材

食品工业 2020年8期

关键词：下脚料激活剂胆碱

刘雪凌，林贝，周学材

燕京理工学院（三河 065201）

从鱼下脚料中提取磷脂酰胆碱的方法有溶剂萃取法、无机盐沉淀法、酶解法等。其中酶解法属于较为安全高效的方法，酶在多因素作用下可以极大地影响酶解速率，因此在单一酶解法的基础上探究复合酶法提取磷脂酰胆碱的工艺能带来更好的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲤鱼下脚料，山东荣信水产食品集团股份有限公司提供；中性蛋白酶（生化试剂），南京奥多福尼生物科技有限公司；胰蛋白酶（生化试剂），上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（生化试剂），天津市化学试剂批发公司；磷酸二氢钾（分析纯），天津市北辰方正试剂厂；钼酸铵（分析纯），上海埃彼化学试剂有限公司；对苯二酚（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂；硫酸（分析纯），深圳市庆茂化工有限公司；乙酸钠（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；乙酸（分析纯），济宁恒泰化工有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市恒兴化学试剂有限公司；EDTA（分析纯），天津大茂化学试剂厂；氯化钠（分析纯），天津市福成化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

FA1004B电子分析天平，上海佑科仪器有限公司；JJ-2组织捣碎机，金坛市万华实验仪器厂；pH计，烟台凯米斯仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；UV-1601紫外分光光度计，北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3 试验方法[1]

1.3.1 试验技术路线

3 g鱼下脚料→复合酶酶解→加入乙醇提取→磷脂酰胆碱提取液→钼蓝比色法测磷含量

其中，钼蓝比色法按GB/T 5537—2008进行。

1.3.2 复合酶法提取工艺的研究

影响复合酶（主要组分为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶及激活剂）法提取鱼下脚料中磷脂酰胆碱的主要因素有酶添加量、酶解pH、酶解时间、酶解温度和激活剂。通过单因素试验和正交试验，确定最佳复合酶酶解法提取磷脂酰胆碱的工艺。

2 结果与讨论

2.1 影响三种蛋白酶提取鱼下脚料中磷脂酰胆碱的因素

2.1.1 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的添加量对磷脂酰胆碱提取的影响

根据之前研究确定木瓜蛋白酶的最佳添加量为0.04%；胰蛋白酶的最佳添加量为0.015%[2-3]。从图1可以看出，当pH为7.5，温度为45 ℃，向鱼下脚料中添加中性蛋白酶的酶量[添加量=（m酶/m原料）× 100%]为0，0.015%，0.020%，0.025%，0.030%，0.035%，0.04%，0.045%和0.05%，酶解时间为60 min时，提取率随三种蛋白酶添加量的增加先是增加然后下降，胰蛋白酶的提取效果最好，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶近似，中性蛋白酶的最适添加量为0.030%。原因可能是酶解产物过多，抑制酶解过程，降低了提取率，还可能是酶属于蛋白质，酶超出适宜量后彼此相互作用影响，降低了提取率。

图1 酶添加量对磷脂酰胆碱提取的影响

2.1.2 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解pH对磷脂酰胆碱提取的影响

根据之前研究确定木瓜蛋白酶的最佳酶解pH为7；胰蛋白酶的最佳酶解pH为9[2-3]。从图2可以看出，当温度为45 ℃，酶解时间为60 min，酶解pH分别设定为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0时，三种蛋白酶对磷脂酰胆碱的提取率均为上升而后下降，酶解pH过高和过低均会影响提取效果。木瓜蛋白酶提取效果最好，中性蛋白酶提取效果次之，其最佳提取pH为7.5。

2.1.3 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解时间对磷脂酰胆碱提取的影响

根据之前研究确定木瓜蛋白酶的最佳酶解时间为100 min；胰蛋白酶的最佳酶解时间为80 min。从图3可以看出，当酶解时间为40，50，60，70，80和100 min时，三种蛋白酶对磷脂酰胆碱的提取率的变化规律一致，都是先上升而后下降。此时，中性蛋白酶的提取效果最好，木瓜蛋白酶次之，中性蛋白酶的最佳酶解时间为80 min。

图2 酶解pH对磷脂酰胆碱提取的影响

图3 酶解时间对磷脂酰胆碱提取的影响

2.1.4 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解温度对磷脂酰胆碱提取的影响

根据之前研究可确定木瓜蛋白酶的最佳酶解温度为50 ℃；胰蛋白酶的最佳酶解温度为37 ℃[2-3]。从图4可以看出，当酶解温度为25，30，35，40，45，50，55和60 ℃时，随着酶解温度的升高，提取率先升高后降低。其中中性蛋白酶提取效果最好，木瓜蛋白酶次之，此时，中性蛋白酶的最佳酶解温度为45 ℃。温度过高，酶容易变性，磷脂酰胆碱也容易分解。

图4 酶解温度对磷脂酰胆碱提取的影响

2.1.5 NaCl和EDTA分别作为激活剂对三种蛋白酶提取磷脂酰胆碱的影响比较

从图5和图6可以看出，当NaCl和EDTA分别作为激活剂并分别添加0.08%时，在三种蛋白酶进行提取时，都是NaCl的激活效果最好。在图6中，当NaCl的加入量从0，0.04%，0.08%，0.12%和0.16%变化到0.2%时，添加量0.12%时的提取率最高。NaCl没有毒性，价钱便宜，少量添加后，对蛋白酶有激活作用，可以增加提取率。

图5 激活剂对磷脂酰胆碱提取的影响

图6 NaCl的添加量对磷脂酰胆碱提取的影响

2.2 用复合酶解法提取革胡子鲶下脚料中磷脂酰胆碱的最佳工艺确定

在单因素试验的基础上，用乙醇作提取溶剂，对A木瓜蛋白酶添加量（0.035%，0.040%和0.045%）、B胰蛋白酶添加量（0.012 5%，0.015 0%和0.017 5%）、C中性蛋白酶添加量（0.025%，0.030%和0.035%）、D氯化钠添加量（0.12%，0.16%和0.20%）、E酶解pH（7.0，7.5和9.0）这5个因素在3个水平上进行优选，采用L18(35)进行正交试验，提取温度为45 ℃，结果见表1。

由表1可知，中性蛋白酶对试验影响最大，木瓜蛋白酶次之，pH的影响也不容忽略，激活剂增加了酶解效率，而胰蛋白酶对试验影响不大，根据各组正交试验结果可得各组优水平，进而选出最佳的复合酶法工艺配方为A2B2C3D3E2，即木瓜蛋白酶添加量为0.04%，添加中性蛋白酶0.03%，胰蛋白酶添加量为0.017 5%，标准氯化钠溶液添加0.20%，pH为7.5。此配方通过使用价格更为低廉的氯化钠溶液，减少了各种酶的用量，不仅减少了经济开销，还增加了提取效率，同时配方的pH温和，对仪器要求不高，损耗也不大。