王慧竹，王禹衡，张兴涛，姜诗宇，陈帅

吉林化工学院化学与制药工程学院（吉林 132022）

罗布麻叶，又名“茶叶花”“野茶”，为夹竹桃科植物罗布麻（Apocynum venetum L.）的干燥叶[1]。罗布麻叶中的化学成分包括黄酮类、有机酸等[2-7]。研究发现，黄酮类是罗布麻主要活性成分，对调节血压、预防高血脂具有良好疗效[5]。泡腾片具有携带方便、分散速度快、有汽水般口感等优点而受到国内外广大消费者的青睐，近几年在食品及保健品生产中的应用逐渐增多[8-10]。目前关于罗布麻制剂主要有复方罗布麻片、复方罗布麻颗粒等，但普通片剂不便于老年人或吞咽功能低的患者使用，并且已上市的制剂并未对罗布麻黄酮的含量进行控制。此次试验采用响应面法对罗布麻黄酮泡腾片（AVET）制备工艺进行优化，同时对AVET的抗氧化活性进行研究，以期为开发罗布麻资源提供更加科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗布麻饮片（吉林大药房，批号20180901）；金丝桃苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-12040302，纯度≥98%）；碳酸氢钠（天津市瑞金特化学品有限公司）；PEG 6000（天津市致远化学试剂有限公司）；柠檬酸（天津市永大化学试剂有限公司）；乳糖（天津市瑞金特化学品有限公司）；酒石酸（天津市北方天医化学试剂厂）；PVP-K30（国药集团化学试剂有限公司）；苹果酸（天津市瑞金特化学品有限公司）；甘露醇（天津市永大化学试剂有限公司）；所有化学试剂均为分析纯，试验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

TDP-6单冲压片机（上海天峰制药设备有限公司）；RE-3000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）；KQ300VDE数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；TU-1950紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FA2004N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SY-3D片剂四用测定仪（上海黄海药检仪器有限公司）；1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括四元低压梯度泵、在线真空脱气机、DAD检测器、Chemstation色谱工作站。

1.3 试验部分

1.3.1 罗布麻总黄酮提取物的制备

称取适量罗布麻叶，粉碎，过60目筛，置于2 000 mL圆底烧瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入适量无水乙醇，回流脱脂4 h，过滤，用适量水洗滤渣，干燥，重新置于2 000 mL圆底烧瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入体积分数60%的乙醇，回流提取2次，时间分别为3和2 h，合并两次滤液，减压回收乙醇，得罗布麻粗提液，并以水为溶剂进行稀释，以0.8 mL/min流速通过AB-8大孔树脂柱，在以水为洗脱剂洗脱至无色时，改用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱部分，回收溶剂，水浴蒸干，真空干燥，研磨，即得罗布麻总黄酮提取物（金丝桃苷含量为5.84%）。

1.3.2 罗布麻总黄酮泡腾片的制备

采用酸碱分开制粒的方法制备泡腾片，将柠檬酸、总黄酮提取物、乳糖（填充剂）、甘露醇（甜味剂）分别研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液为粘合剂，制软材，过16目筛制酸粒；将碳酸氢钠、总黄酮提取物、乳糖、甘露醇分别研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液为粘合剂，制软材，过16目筛制碱粒。将酸粒、碱粒分别干燥后混合均匀，加入润滑剂PEG-6000，混合均匀，压片。

1.3.3 罗布麻总黄酮泡腾片质量评价

片重差异的测定：取20片该品，精密称定总质量和每片的质量，经每片质量与平均质量比较，即可得出罗布麻总黄酮泡腾片的片重差异。

硬度的测定：随机取6 片泡腾片，分别放入SY-3D片剂四用测定仪中的压板之间，开动机器，沿径向方向缓缓加压，片剂刚好碎裂时的力即为泡腾片的硬度，计算平均值。

脆碎度的测定：随机取10片泡腾片，精密称定质量，置于SY-3D片剂四用测定仪塑料圆筒内，开动机器，以25 r/min速度转动4 min，取出，用吹风机吹去片剂表面脱落的粉末，精密称重，计算减失质量比。

崩解时限的测定：取1片泡腾片，置于250 mL烧杯（内有200 mL温度20±5 ℃的水）中，即有许多气泡放出，当片剂或碎片周围的气体停止逸出时，片剂应溶解或分散在水中，无聚集的颗粒剩留，同法再取6片进行检查，各片均应在5 min内崩解。

发泡量的测定：取10支25 mL具塞刻度试管，每支试管加2.0 mL蒸馏水，置37±1 ℃水浴中5 min，各管中分别投入1片罗布麻总黄酮泡腾片，20 min内观察最大发泡量的体积，平均发泡体积不得少于6 mL。

pH的测定：泡腾片6片，分别置于6个100 mL烧杯（内有50 mL温度为20±5 ℃蒸馏水）中，使其发泡溶解，带气泡消失后，搅拌均匀测定各溶液pH，计算平均值。

泡腾片中金丝桃苷含量的测定：定量精密称取金丝桃苷，制成质量浓度为0.18 mg/mL的对照品溶液，精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL金丝桃苷对照品溶液，置于2 mL容量瓶中，分别得到浓度为18，36，54，72和90 μg/mL的对照品溶液，分别精密吸取上述浓度的对照品溶液，注入液相色谱仪，按色谱条件进行分析：采用色谱柱ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（含1%冰乙酸，B）-水溶液（含0.4%磷酸，D），梯度洗脱程序：0～15 min，5%～10% B；15～20 min，10%～11% B；20～35 min，11%～15% B；35～42 min，15%～16%；42～50 min，16%～33% B；50～55 min，33%～90% B；55～60 min，90% B，柱温55 ℃，体积流量0.8 mL/min，检测波长360 nm，定量环进样10 μL，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。另随机取3批自制罗布麻总黄酮泡腾片，每批10片，研碎，精密称取2.0 g粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL 60%乙醇，超声处理20 min后离心（10 000 r/min），取上清液置于50 mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液，后经0.45 μm微孔滤膜过滤，按标准曲线绘制方法测定金丝桃苷含量。

1.3.4 泡腾片的感官评价

泡腾片的口感、溶解效果、产品外观采用感官评价，评分标准如表1所示。具体评价过程采用盲样评价法，即选取20名接受过感官评价训练的志愿者组成感官评价小组，随机抽取泡腾片样品，进行冲调，并对冲调后饮品的口感、溶解效果、产品外观进行评分[9,11]。感官评分=口感（40%）+外观（30%）+溶解效果（30%）。

表1 罗布麻总黄酮泡腾片评分标准

1.3.5 泡腾片制备工艺的单因素试验

罗布麻茶收载于《中国药典》2015年版一部，规定每袋（3.0 g）含罗布麻叶以金丝桃苷计不得少于6.0 mg，参照此标准，结合自制泡腾片的质量（规格：1.0 g/片），模拟计算可知，固定罗布麻总黄酮提取物在处方中的比例10.5%，每1片泡腾片可相当于1袋罗布麻茶来使用。在前期工作基础上，分别选择了柠檬酸为酸源、碳酸氢钠为碱源、乳糖为填充剂、PEG 6000为润滑剂，为优化泡腾片的制备工艺，固定罗布麻总黄酮提取物在片剂中的比例为10.5%，以感官评分作为评价指标，探索酸碱总用量（30%，35%，40%，45%和50%）、酸碱配比（柠檬酸与碳酸氢钠质量比0.8∶1，1∶1，1.2∶1，1.4∶1和1.6∶1）、PEG 6000的用量（3%，4%，5%，6%和7%）对罗布麻总黄酮泡腾片质量的影响。

1.3.6 泡腾片制备工艺的响应面试验

在单因素试验结果基础上，根据BBD原理，选取酸碱总用量（X1）、酸碱配比（X2）、PEG 6000用量（X3）三个因素作为变量，以感官评价为评分（Y）为因变量设计响应面试验，试验设计的因素及水平编码值如表2所示。

表2 泡腾片制备工艺优化响应面试验因素与水平

1.3.7 罗布麻总黄酮泡腾片抗氧化活性

维生素C储备溶液的配制：精密称取0.008 2 g维生素C（VC）置于100 mL棕色容量瓶中，以无水甲醇为溶剂定容，摇匀，即得质量浓度为82 μg/mL的VC储备液，于4 ℃保存备用。

DPPH储备溶液的配制：精密称取0.055 0 g DPPH，置于250 mL棕色容量瓶中，加入无水甲醇溶解，定容，摇匀，即得质量浓度为0.22 mg/mL的DPPH溶液，于4 ℃避光保存。

DPPH清除自由基能力的测定：取2片泡腾片样品，投入10 mL水中，待完全溶解后，转移至25 mL容量瓶中，定容，得到质量浓度为8.4 mg/mL（以罗布麻总黄酮提取物在溶液中浓度计）的供试溶液，分别吸取0.2，0.6，1.2，1.6，2.0和2.5 mL供试溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，分别加入1.5 mL DPPH储备液，分别加入无水甲醇稀释，定容，摇匀，避光反应30 min，于515 nm测定吸光度Ai（供试溶液+DPPH溶液+无水甲醇）；不加供试溶液按同样方法测定A0（DPPH溶液+无水甲醇）；不加DPPH储备液按同样方法测定Aj（供试溶液+无水甲醇）。按式（1）计算样品对DPPH自由基的清除率CLS，以提取液浓度为横坐标，清除率为纵坐标进行曲线拟合[12]，根据回归方程计算半数清除浓度（IC50）。

精密量取1 mL VC储备液，置于5 mL容量瓶中，无水甲醇稀释定容，分别精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL稀释后的VC溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，按样品DPPH清除自由基能力测定方法测得Ai'（VC溶液+DPPH溶液+无水甲醇）、A0'值（DPPH溶液+无水甲醇）、Aj'值（VC溶液+无水甲醇），按式（2）计算VC对DPPH自由基的清除率CLc，以提取液浓度为横坐标，清除率为纵坐标进行曲线拟合，根据回归方程计算VC的IC50值。

1.3.8 数据的分析处理

使用SPSS 22.0软件对试验结果进行统计分析，使用Minitab 16.3软件进行响应面试验设计，使用Origin 2016软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 AVET中金丝桃苷含量的测定

按1.3.3项下方法分别进样对照品溶液和供试品溶液，色谱图如图1所示，其中1号峰为金丝桃苷。

图1 金丝桃苷对照品（A）和AVET供试品（B）色谱图

以金丝桃苷对照品的浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得方程Y=2 344X-2.140 8（R2=0.999 9），罗布麻总黄酮泡腾片中金丝桃苷含量测定结果如表3所示。

表3 3批罗布麻总黄酮泡腾片中金丝桃苷含量测定结果

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酸碱总用量对感官评分的影响

从图2可以看出，当酸碱总用量为30%～40%时，感官评分随酸碱总用量增大而升高；当酸碱总用量达到40%时，感官评分最大，为4.35分；当酸碱总用量＞40%后，感官评分开始逐渐降低，可能是酸碱总用量增加后，泡腾片的口感偏酸所致。因此选择酸碱总用量30%，40%和50%进行响应面试验。

2.2.2 酸碱配比对感官评分的影响

从图3可以看出，当酸碱配比为0.8∶1～1.2∶1时，感官评分随酸碱配比增大而升高；当酸碱配比达到1.2∶1时，感官评分最大，为4.38分；当酸碱配比＞1.2∶1后，感官评分开始逐渐降低，可能是酸碱配比增加后，处方中柠檬酸的量相对增多，影响了泡腾片的口感和溶解性所致。因此选择酸碱配比1∶1，1.2∶1和1.4∶1进行响应面试验。

图2 酸碱总用量对感官评分的影响

图3 酸碱配比对感官评分的影响

2.2.3 PEG 6000用量对感官评分的影响

从图4可以看出，当PEG 6000用量为3%～6%时，感官评分随PEG 6000用量增大而增大；当PEG 6000用量达到6%时，感官评分最大，为4.25分；当PEG 6000用量＞6%后，感官评分略有下降，可能是PEG 6000用量过少，压片易黏冲，影响泡腾片的外观，而PEG 6000用量过大，影响泡腾片在水中的溶解性。因此选择PEG 6000用量5%，6%和7%进行响应面试验。

图4 PEG 6000用量对感官评分的影响

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验分析

利用Minitab 16.3软件对表4中数据进行分析处理，得到以Y为因变量，X1、X2、X3为自变量的三元二次方程：Y=-59.935+1.662X1+16.668X2+7.667X3+0.295X1X2-0.054 5X1X3-0.450X2X3-0.021 7X12-11.481X22-0.407X32，对此模型进行方差分析及显著性检验，结果见表5。

表4 响应面试验设计及结果

表5 回归模型方差分析

从表5可以看出，回归模型的p=0.000 4，显著性分析结果为极显著（p＜0.01）；失拟项的p=0.523 3＞0.05，说明模型的拟合程度良好，影响拟合的因素对试验结果干扰很小；方程决定系数R=0.863 2，说明响应值的变化有86.32%来源于所选变量，由此反映出回归模型的拟合程度良好，试验误差小，可用该回归方程代替试验实际值进行分析和预测泡腾片的感官评分值。从表5还可看出，X1、X2、X1X2、X1X3项对感官评分值影响显著（p＜0.05），X12、X22、X32对试验结果影响极显著（p＜0.01），而其他线性项和交互项影响则不显著（p＞0.05），由此反映试验选定的各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

2.3.2 响应曲面分析

为了更加清晰表达两个因素的交互作用对泡腾片感官评分的影响，在固定X1、X2、X3中任意一个因素的值为零水平对应实际值的基础上，考虑另外两个因素对感官评分的影响，根据回归模型绘制响应曲面图和等高线图[13-14]，结果如图5所示。

从图5可以看出，酸碱总量、酸碱比例对感官评分值影响比较明显，而酸碱总量和酸碱比例、酸碱用量和PEG 6000用量之间的交互作用对试验结果影响也比较显著，这与表5的方差分析结果相吻合。

图5 两因素交互作用对感官评分值影响的响应曲面和等高线图

利用Minitab软件同时得到回归模型优化的泡腾片最佳制备工艺参数：酸碱总用量37.88%、酸碱配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，罗布麻总黄酮泡腾片感官评分为4.64%。考虑到实际生产的可操作性，将上述工艺参数修正为：酸碱总用量38%、酸碱配比1.16∶1、PEG 6000用量6%。在此工艺条件下，重复3次平行验证试验，罗布麻总黄酮泡腾片感官评分为4.61%，实际感官评分与理论感官评分的差值仅占理论提取率的0.65%，说明由模型方程优化的最佳工艺条件稳定可靠。

2.4 罗布麻总黄酮泡腾片质量评价

按照《中国药典》的要求检查泡腾片的各项指标。制得的AVET外观光滑均匀，平均片重1.0±0.04 g，未发现片重超过规定限度，崩解时限均在5 min以内，所得溶液呈弱酸性，每片泡腾片发泡量10.4±0.18 mL，脆碎度0.81%±0.04%，每片泡腾片中金丝桃苷含量为56.1±0.26 mg/片。

2.5 抗氧化试验结果

由图6可知，AVET对DPPH自由基有明显的清除作用，且随样品质量浓度的加大清除率呈上升趋势，当质量浓度为0.504 mg·mL-1时，AVET对DPPH自由基清除率达到55.01%，但AVET对DPPH自由基清除率低于同浓度的VC。分别对AVET和VC浓度与清除率进行曲线回归，得方程：Y（ATB）=31.63lnX+108.21（R2=0.983 9），Y（VC）=52.02lnX+78.53（R2=0.979 7）。通过计算可求得AVET和VC对DPPH自由基的IC50分别为0.010 7和0.007 3 mg·mL-1，表明AVET对DPPH自由基清除能力弱于VC。

图6 罗布麻总黄酮泡腾片和VC对DPPH自由基的清除能力的影响

3 结论

此次试验以罗布麻总黄酮为原料，旨在制备携带方便、口感好、容易吸收的泡腾片。通过单因素试验结合响应面的方法，以产品外观、口感、溶解性能作为重要考察指标，采取综合评分法，对泡腾片的制备工艺进行优化，及原辅料用量进行优化，最终确定酸碱总用量38%、酸碱配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，在此条件下制得泡腾片外观光滑均匀，酸甜适中，口感柔和可口，反应剧烈，崩解迅速，溶解性能良好，综合评分为4.61分。泡腾片的片重差异、硬度、脆碎度、崩解时限、pH、发泡量等指标均符合规定。此外，此次试验还对AVET的体外抗氧化活性进行了研究，结果表明AVET具有体外抗氧化活性，但抗氧化能力要弱于维生素C，研究结果对于更好地开发利用罗布麻资源提供重要的依据。