陈平，朱爱国，陈继康，高钢，陈坤梅，喻春明

中国农业科学院麻类研究所（长沙 410205）

苎麻为荨麻科（Urticaceae）苎麻属（Boehmeria）多年生草本植物，是我国传统的纤维作物。苎麻纤维具有吸湿、散热的特性，被誉为“中国草”。苎麻具有适应性强、生长快、产量高的特点，一年可收获三季，亩产（1亩=0.067 hm2）鲜物质5 300 kg[1]。收获的纤维只占总产量的1/10左右，大量的叶片等副产物没有得到很好利用。苎麻叶片中粗蛋白含量在20%以上，必需氨基酸含量丰富，是优良的植物蛋白原料[2-5]。苎麻副产物作为反刍动物的蛋白饲料开发也逐渐得到重视[3,6-9]，但其在食品工业中的研究还鲜见报道。研究苎麻叶中的蛋白质提取工艺用于开发相关食品或保健食品，不仅有利于丰富植物蛋白产品种类、充分利用我国的苎麻产业的副产物资源，而且为进一步进行苎麻叶蛋白质的深入研究和多肽氨基酸的制备提供基础。

超声波辅助提取法，具有操作简便快捷、不破坏提取物原有结构和活性的优点，是一种有效的叶蛋白浸提方法，已在黄粱木[10]、紫花苜蓿[11]、酿酒高粱[12]蛋白质提取中取得较好的效果。此次试验利用超声波辅助浸提苎麻叶片中蛋白质，通过浸提液中蛋白质浓度测定，计算蛋白质提取率，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化超声波提取工艺参数，为苎麻叶蛋白工业提取提供试验科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苎麻材料，纤饲兼用品种“中苎2号”[13]叶片，2017年5月采集于中国农业科学院麻类研究所望城试验基地。采后65 ℃烘干48 h，粉碎过40目筛，备用。

Bradford蛋白试剂盒，南京建成生物科技有限公司；盐酸，国产分析纯（AR）。

1.2 仪器与设备

高速离心机（Neofuge 1600R），上海力申科学仪器有限公司；pH计（FE28）、电子天平（ME204），梅特勒-托利多仪器有限公司；水浴恒温振荡器（THZ-82A），常州荣华仪器制造有限公司；试管振荡混合器（SK-2型），江苏保庆分析设备厂；紫外分光光度计（UV-5100），上海元析仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（101型），上海科恒实业发展有限公司。

1.3 基本化学成分测定

蛋白质含量测定，凯氏定氮法；粗脂肪含量测定，索氏抽提法；粗纤维含量测定，过滤法；灰分含量测定，直接灰分法。

1.4 试验方法

1.4.1 叶蛋白的提取工艺

苎麻叶片→于65 ℃烘干48 h→粉碎过40目筛→加入蒸馏水→（超声波）浸泡提取→过滤→黄褐色澄清透明浸提液

采用Bradford法测定蛋白质浓度，并计算提取率（叶片蛋白质含量使用凯氏定氮法测定）。此处提取率为浸出液中蛋白总量与试样中蛋白总量的比值。

1.4.2 单因素试验设计

首先做单因素试验，研究超声波破壁时间、浸提温度、料液比以及浸提时间对苎麻叶蛋白质提取率的影响。然后在此基础上采用正交试验设计得到最佳工艺条件。

超声波时间的选择：称取1 g苎麻叶粉末，加35 mL蒸馏水（料液比1∶35 g/mL），调节pH 12，充分搅拌混匀，于功率150 W超声波提取0，4，8和12 min，并在25 ℃振荡水浴锅中提取20 min，离心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，测定其OD值，根据所做出的标准曲线，计算蛋白质浓度，选择浓度最高时的所用时间，为最佳粉碎时间。

料液比的选择：称取1 g苎麻叶粉末，分别按不同料液比（1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL）加入蒸馏水，调节pH 12，充分搅拌混匀，于功率150 W超声波提取8 min，并在25 ℃振荡水浴锅中提取20 min，离心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，测定其OD值，计算蛋白质浓度及提取率。

提取时间的选择：称取1 g苎麻叶粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸馏水，调节pH 12，充分搅拌混匀，于功率150 W超声波提取8 min，并在25 ℃振荡水浴锅中分别提取20，40，60，80和100 min，离心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，测定其OD值，计算蛋白质浓度及提取率。

提取温度的选择：称取1 g苎麻叶粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸馏水，调节pH 12，充分搅拌混匀，于功率150 W超声波提取8 min，分别在25，35，45，55和65 ℃振荡水浴锅中提取20 min，离心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，测定其OD值，计算蛋白质浓度及提取率。

pH的选择：称取1 g苎麻叶粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸馏水，调节pH为7，8，9，10，11和12，充分搅拌混匀，于功率150 W超声波提取8 min，在55 ℃振荡水浴锅中分别提取20 min，离心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，测定其OD值，计算蛋白质浓度及提取率。

1.4.3 最佳工艺条件的选择

在单因素试验的基础上，以料液比、pH、浸提时间和浸提温度为考察因素，以苎麻叶蛋白提取率为考察目标，采用L9(34)正交表进行正交试验设计。在不设置空列的情况下，各处理均重复3次，用以估计误差。

1.5 数据分析

每组试验重复3次，采用Excel 2016、SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素Turkey方差分析、正交方差分析等处理，以获得最佳组合。

2 结果与分析

2.1 干苎麻叶基本化学成分

由表1可知，苎麻叶片中的蛋白质含量为21.84%，脂肪含量为4.82%，粗纤维含量为24.49%，灰分含量为12.46%。

表1 干苎麻叶基本化学成分 %

2.2 单因素试验

2.2.1 超声波时间的选择

由图1可知，超声波时间在8 min内，随着超声波处理时间的增加，苎麻叶蛋白的提取率逐渐增加。超声波处理12和8 min对提取率的影响无显著差异（p＜0.05），因此选定8 min作为超声波处理的时间。

图1 超声波时间对苎麻叶蛋白提取率的影响

2.2.2 料液比对叶蛋白提取率的影响

由图2可知，叶蛋白提取率随着料液比增加而提升，当料液比达到1∶45（g/mL）时，提取率为3.53%。随着料液比继续增加，叶蛋白提取率增长幅度较小。而当料液比增加时，提取液中蛋白质浓度降低，这将使蛋白质沉降率下降。因此选定料液比1∶35，1∶45和1∶55（g/mL）作为正交试验的三个水平。

图2 料液比对苎麻叶蛋白提取率的影响

2.2.3 提取时间对叶蛋白提取率的影响

由图3可知，蛋白质提取率随着提取时间的延长而增加。当提取时间达到60 min后，蛋白质的提取率变化不大。出于节约时间和能量考虑，选择40，60和80 min作为正交试验的三个水平。

2.2.4 pH对叶蛋白提取率的影响

由图4可知，在pH 7～11之间，苎麻叶蛋白的提取率逐渐上升；当pH为11时，提取率为5.73%，达到最高；当pH为12时，苎麻叶蛋白的提取率出现下降趋势。说明pH 11时苎麻叶蛋白已经达到最大限度的溶解。pH再升高，可能导致苎麻叶蛋白发生变性，提取率反而降低。所以选择pH 10，11和12作为苎麻叶蛋白提取正交试验的三个水平。

图3 提取时间对苎麻叶蛋白提取率的影响

图4 pH对苎麻叶蛋白提取率的影响

2.2.5 提取温度对叶蛋白提取率的影响

由图5可知，随着温度的升高，苎麻叶蛋白的溶出率逐渐升高。当温度升高到45 ℃后，提取率变化较小，这是由于此时苎麻叶蛋白已经达到最大限度的溶解。因此，选择35，45和55 ℃作为正交试验的三个水平。

图5 温度对苎麻叶蛋白提取率的影响

2.3 最佳工艺条件的选择

正交试验因子水平见表2，按照表2设计L9(34)正交试验，结果见表3。

表2 L9(34)正交因子水平表

表3 L9(34)正交试验结果

使用SPSS 20.0对正交试验结果进行方差分析，结果见表4。提取时间、料液比、pH和提取温度对叶蛋白提取率影响均极显著（p＜0.01），各因素对苎麻叶蛋白质得率的影响大小依次为提取时间＞提取温度＞料液比＞pH，即在碱提过程中，提取时间对苎麻叶蛋白质提取率影响最大，提取温度和料液比次之，pH最小。

表4 正交试验结果方差分析结果

苎麻叶蛋白的最优组合为A2B2C2D2，即最佳提取条件为料液比1∶45（g/mL）、pH 11、温度45 ℃、提取时间60 min。经验证，该条件下的苎麻叶蛋白的提取率为11.26%，高于正交试验的所有组合，数据稳定可靠。

3 讨论与结论

在单因素试验中，超声波辅助提取8 min，叶蛋白的提取率最高；处理12 min，提取率略有下降，但与8 min时的提取率差异不显著。由于超声波热效应，试验中温度控制较为困难，在实际生产中，仍需解决这个问题。

试验结果表明：提取时间、料液比、pH和提取温度对叶蛋白提取率的影响均极显著（p＜0.01），各因素对苎麻叶蛋白质得率的影响大小依次为提取时间＞提取温度＞料液比＞pH。最佳提取条件为料液比1∶45（g/mL）、pH 11、温度45 ℃、提取时间60 min，提取率达11.26%，该工艺通过超声波处理能高效提取苎麻叶片中的蛋白质，为实际生产提供一定理论依据。