程国强 董涵 王永金 夏介英 洪杨

摘要：为了探讨芍黄颗粒对小鼠银屑病模型的治疗作用，采用咪喹莫特致小鼠银屑病模型观察芍黄颗粒对银屑病模型小鼠皮损组织病理变化、表皮厚度及皮肤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响;采用小鼠阴道上皮病理模型及小鼠尾鳞片上皮病理模型观察芍黄颗粒对小鼠阴道上皮有丝分裂及小鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响。结果表明，与模型组比较，芍黄颗粒各剂量组均能显著减小银屑病模型小鼠皮肤厚度（P<0.05），芍黄颗粒5.0、10.0g/kg剂量对小鼠背部皮损有改善作用且能显著减少小鼠皮肤组织中PCNA蛋白表达量;芍黄颗粒10.0g/kg剂量能明显抑制小鼠阴道上皮细胞有丝分裂，对小鼠尾鳞片表皮颗粒层形成有显著促进作用。表明芍黄颗粒可通过影响表皮细胞过度增殖、角化不全而减小皮肤厚度、改善皮损，抑制阴道上皮细胞有丝分裂，促进小鼠尾鳞片表皮颗粒层形成等来治疗银屑病，为银屑病治疗的有效药物。

关键词：芍黄颗粒;银屑病;动物模型

中图分类号：R285.5 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）09-0137-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.029

银屑病是一种常见的顽固性皮肤病，病程较长，易复发。该病发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状况影响较大川。临床表现以红斑、鳞屑为主，全身均可发病。有关该病的病因虽然进行过许多研究，但至今尚不十分清楚。目前认为，该病的发生不是单一的原因，可能涉及多方面，如遗传、感染、内分泌因素、免疫异常等。该病目前尚无特效疗法，适当的对症治疗可以控制症状。由于该病是一种慢性复发性疾病，不少患者需要长期医治。西医治疗银屑病主要有联合疗法、交替疗法、序贯疗法和间歇疗法等，而各种疗法都有一定的不良反应[2，3]。

祖国传统医学认为血热是银屑病发病的重要原因，风热之邪结聚于皮肤，则局部的气血运行失畅，气血久郁则血热，红斑是血中有热的表现，白屑是热盛血燥、皮肤失养所致[4]。芍黄颗粒由赤芍、生地黄、牡丹皮、蒲公英、金银花、白茅根组成，具有镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉、免疫调节等作用。本试验采用咪喹莫特致小鼠银屑病样皮损模型、鼠尾鳞片颗粒层模型及小鼠阴道上皮病理模型，观察芍黄颗粒对银屑病的治疗作用，为其临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品 芍黄颗粒由赤芍、生地黄、牡丹皮、蒲公英、金银花、白茅根等组成，试验用中药材购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，经四川省中医药科学院资源所专家鉴定为正品。药物经水煎煮提取有效成分、浓缩，加一定比例辅料，烘箱低温干燥制成棕黄色颗粒，1g相当于原生药1.5g;哙喹莫特乳膏，四川明欣药业有限责任公司;苯甲酸雌二醇注射液，天津金耀氨基酸有限公司;秋水仙碱，上海如吉生物科技发展有限公司;雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司;复方青黛胶囊，陕西天宁制药有限责任公司;小鼠增殖细胞核抗原（PCNA）抗体，Ab-cam（上海）贸易有限公司;Mouse E-Selectin ELISAKit、Mouse Endothelin 1（ET-1）ELISA Kit，CUSA-BIO BIOTECH CO.，LTD.。

1.1.2 试验仪器 JA1003A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司;JY10001型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司;CX21型生物显微镜，广州奥林巴斯工业有限公司;Varioskan Flash酶标仪，Thermo出品;BA200型Digital数码三目摄像显微摄像系统，麦克奥迪实业集团有限公司;Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，美国Media Cybernetics。

1.1.3 试验动物 SPF级昆明小鼠，由四川省中医药科学院实验动物中心提供。试验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-19。

1.1.4 试验环境 四川省中医药科学院药理毒理研究所SPF屏障系统，室内温度20～22℃，相对湿度40%～70%，光照采用12h明亮、12h黑暗，合格证号为SYXK（川）2013-100。自由饮水。全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 芍黄颗粒对咪喹莫特致小鼠银屑病模型的影响试验取雌雄各半小鼠60只，将背部毛剃干净，10只为正常对照组，其余小鼠均背部涂抹咪喹莫特乳膏，涂抹面积为2cm²，每天1次，每次约60mg，连续涂8d[5-7]。将制备好的咪喹莫特模型小鼠50只随机分为5组，每组10只，分别为芍黄颗粒10.0、5.0、2.5g/kg剂量组、模型组和阳性药物（雷公藤多苷片）组。共6组。芍黄颗粒组分别灌胃相应剂量药物，阳性药物组按0.1g/kg给予雷公藤多苷片，正常对照组与模型组小鼠给予等体积0.5% CMC-Na溶液，每天2次，连续14d;给药期间除正常对照组外均隔日涂抹咪喹莫特乳膏。建模过程中观察小鼠背部皮损变化情况。给药结束后，剪取各组小鼠皮损皮肤，常规组织切片，经HE染色后观察皮肤病理学变化，并测量表皮厚度;剪取各组小鼠皮损皮肤，石蜡包埋、切片经免疫组化处理观察PCNA的表达水平。

1.2.2 芍黄颗粒对鼠尾鳞片颗粒层模型的影响试验取小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、芍黄颗粒10.0、5.0、2.5g/kg剂量组。芍黄颗粒组分别灌胃给予相应药物，正常对照组给予等体积0.5%CMC-Na溶液，每天2次，连续14d。末次给药1h后处死小鼠，在距尾根部约2cm处取尾背部皮肤一条，长约2cm，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。在光镜下观察鼠尾鳞片颗粒层形成情况，计数100个鳞片中有颗粒层的鳞片数[8]。

1.2.3 芍黄颗粒对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响试验取雌性小鼠60只，10只为正常对照组，腹腔注射生理盐水;其余50只腹腔注射苯甲酸雌二醇0.2mg/10g，每日1次，连续3d，使其处于雌激素期。第4天将处于雌激素期的小鼠随机分为5组，每组10只，即模型组、阳性药物（复方青黛胶囊）组、芍黄颗粒10.0、5.0、2.5g/kg剂量组。芍黄颗粒组分别灌胃给予相应药物，阳性药物组按1.0g/kg给予复方青黛胶囊，模型组与正常对照组给予等体积0.5%CMC-Na溶液，每日2次，连续5d。由于细胞有丝分裂的昼夜节律性，每组试验时间应统一。第6天上午各组小鼠腹腔注射秋水仙碱2mg/kg，6h后处死小鼠，取阴道组织，常规组织切片处理，HE染色，光镜下计数300个阴道上皮基底细胞的有丝分裂数[9，10]。

1.2.4 统計学处理 采用SPSS17.0统计分析软件，试验数据均以平均数士标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 咪喹莫特致小鼠银屑病样动物模型皮损的外观形态变化

与正常对照组比较，咪喹莫特模型组小鼠在涂抹咪喹莫特1～2d后皮肤即出现红斑、鳞屑及增厚现象，皮损症状在7～8d最为严重，呈典型的银屑病样改变。随着时间延长，模型组小鼠皮损日益严重，红斑由少量淡粉色斑点变为大面积深红偏棕褐色斑块;鳞屑由琐碎状增多增厚，过渡至布满裸露皮肤的层状鳞屑;皮肤逐渐褶皱、隆起，增厚浸润明显。芍黄颗粒高、中、低剂量组和雷公藤多苷片组小鼠皮损症状与模型组比较有所减轻，鳞屑较少，红斑量少且色浅，增厚浸润程度较轻。

2.2 芍黄颗粒对银屑病样小鼠模型皮损的病理学变化及皮肤厚度的影响

由表1可知，与模型组比较，芍黄颗粒各剂量组均能显著降低银屑病模型小鼠的皮肤厚度（P<0.05）。

HE染色结果（图1）显示，正常对照组小鼠皮肤角质层、颗粒层、棘细胞层很薄;模型组小鼠皮肤过度角化、棘层增厚;芍黄颗粒能使小鼠皮肤角化过度减轻、棘层变薄，表皮层厚度明显低于模型组。

2.3 芍黄颗粒对银屑病小鼠PCNA表达水平的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型组小鼠皮肤组织中PCNA蛋白含量极显著升高（P<0.01），提示造模成功。10.0和5.0g/kg芍黄颗粒组小鼠皮肤组织中PCNA蛋白含量极显著降低（P<0.01）2.5g/kg芍黄颗粒组小鼠皮肤组织中PCNA蛋白含量与模型组比较无明显差异。

图2为光镜下观察PCNA阳性表达率情况。阳性物质呈棕黄色颗粒状，正常对照组小鼠阴道上皮细胞中PCNA主要表达于基底层细胞，且着色较浅;与正常对照组比较，模型组PCNA的表达明显增强，在基底层和部分棘层均有活跃表达，而且着色较深;10.0、5.0g/kg芍黄颗粒与0.1g/kg雷公藤多苷片可明显抑制PCNA的表达。

2.4 芍黄颗粒对鼠尾鳞片颗粒层模型的影响

由表3可见，与正常对照组比较，10.0g/kg芍黄颗粒组鼠尾有颗粒层的鳞片数极显著升高（P<0.01）。

2.5 芍黄颗粒对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响

由表4可见，与模型组比较，10.0g/kg芍黄颗粒组小鼠阴道上皮有丝分裂指数显著降低（P<0.05）。

3 小结与讨论

咪喹莫特为Toll样受体激动药，其与表皮浆细胞样树突状细胞及巨噬细胞内的TLR7结合，分泌大量的干扰素α以及多种白细胞介素致动物表皮角化过度、角化不全、棘层肥厚、血管生成和炎细胞浸润等人类银屑病的组织病理学改变[11]。

雌激素期的小鼠阴道上皮细胞增殖活跃，基底层有丝分裂增加，上皮细胞转换加快，可模拟银屑病表皮增殖加速的特点，以评价药物抑制细胞有丝分裂的作用，药物如能抑制小鼠阴道上皮基底细胞的有丝分裂，说明其可能抑制银屑病表皮的增生，从而具有改善作用。正常情况下，小鼠尾部鳞片的表皮角质层角质形成细胞保留有细胞核，而颗粒层细胞缺失，其天然的角化形式与人类银屑病表皮相似，可以模拟银屑病角化不全的特点，药物如果能促进鼠尾鳞片表皮生成颗粒层，则说明其可能改变银屑病表皮的角化不全，从而具有改善作用。以上3种模型被作为筛选抗银屑病药物的常用模型[12-14]。

本试验选用上述3种常用模型评价芍黄颗粒对银屑病的药效学作用。结果表明，不同剂量芍黄颗粒均能降低银屑病模型小鼠的皮肤厚度，使小鼠皮肤角化过度程度减轻、棘层变薄，表皮层厚度明显低于模型组。高剂量芍黄颗粒能使鼠尾有颗粒层的鳞片数明显增多，促进鼠尾鳞片表皮生成颗粒层，说明其可能改变银屑病表皮的角化不全。增殖细胞核抗原（PCNA）与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态良好的指标，用PCNA标记可从分子水平反映上皮细胞增殖程度的变化。在正常表皮细胞中，PCNA表达水平较低，而在银屑病中由于表皮基底细胞增生加速，PCNA表达明显增强。本试验结果显示，中、高剂量芍黄颗粒能显著抑制银屑病模型小鼠皮肤组织中PCNA蛋白表达量，与谢青等[15]研究结果一致。同时，高剂量芍黄颗粒使小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数明显降低，可抑制小鼠阴道上皮基底细胞的有丝分裂，说明其可能抑制银屑病表皮的增生，从而具有改善银屑病作用，这也与芍黄颗粒抑制银屑病模型小鼠皮肤组织中PCNA蛋白表达量结果一致。综上可知，芍黄颗粒对银屑病症状有很好的改善作用，其作用机制有待进一步研究。

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收稿日期：2019-07-09

基金项目：四川省省级公益性科研院所基本科研业务专项（A-2018N-24）;四川省中医药管理局中医药科学技术研究专项（2018QN041）

作者简介：程国强（1984-），男，河南课河人，助理研究员，主要从事中药药理、实验动物模型研究，（电话）028-85247897（电子信箱cheng-gq110@163.com;通信作者，洪杨（1986-），女，四川成都人，助理研究员，主要从事动物营养学研究，（电话）18384125659（电子信箱）452663212@qq.com。