吴继阳，王 冰

(辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110000)

近几年来，随着国家禽业规模集约化程度不断提高，鸡群养殖工作质量得到明显提高，但同时也出现了鸡群混合感染和二次感染情况。鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒是这其中最为常见，也是危害最大的疾病，已经得到了人们的高度重视。从症状上看，3种疾病临床特征较为相似，难以区分，必须要通过实验室的具体验证后进行确诊。本文通过设计鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒的特异性扩增引物，建立形成三重PCR检测方法体系，不仅弥补了传统PCR检测方法中存在不足，同时也进一步提高了检测效率。因此，急需要建立形成一个高效快速的检测方法，降低病毒危害。

为了判断三重PCR检测方法的实际应用效果，分别从各类实验室购置了鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒。在此基础上，完成对基因的设计和合成，并且形成特异性引物序列表，其中3种病毒的扩增产物长度分别为687bp、453bp、239bp。在此基础上，对三重PCR检测方法反应条件性全面的优化设计，完成特异性、敏感性、重复性试验。

1 测试结果分析

采用三重PCR检测方法条件，对鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒的单一模板和混合模板展开了进一步的检测。从实际结果来看，分别检测出了最初的3种病毒的扩增产物长度，分别为687bp、453bp、239bp。而且对照病原体均呈现阴性，由此可知，该种检测方式特异性良好。从敏感性实验来看，鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒的原始核酸浓度分别为25.3ng/μL、63.6ng/μL、20.1ng/μL，而三重PCR检测方法下测出的数据分别为2.5pg、6.4pg、2.0pg，由此可知，该种方法的敏感性较高。图1、图2和图3分别为三重PCR检测方法特异性、敏感性以及重复性的实验结果。在此基础上进一步对鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测方法的重复性进行试验，从混合模板的结果来看，在反复5次的试验过程中，均可以扩增出相应的特异性条带，且条带均匀一致，可以确定三重PCR检测方法的重复性好。从特异性、敏感性、重复性这三方面的试验结果可以看出，三重PCR检测方法应用在鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒具有较大的优势，不仅可以完成单一模板的检测，同时还能够完成混合模板的检测，并其将混合的病毒有效分离。

图 1 三重PCR检测方法特异性试验结果

图 2 三重PCR检测方法敏感性试验结果

图 3 三重PCR检测方法重复性试验结果

2 临床检测效果

在此基础上，进一步对鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测的临床应用效果进行分析。以广西地区多个养鸡场中取出50份样品，在送样后得到的检测结果如下。有1份鸡新城疫病毒阳性、9份鸡细小病毒阳性和2份禽流感病毒阳性样品，其中包含2份鸡细小病毒和禽流感病毒均呈阳性的样品，1份鸡细小病毒和鸡新城疫病毒均呈阳性的样品。由此可知，该养鸡场中已经出现混合感染的病例，其他养鸡场要立即开展相应的防控处理。经过前文的对比分析来看，在对阳性的样品进行克隆和序列分析的过程中发现，阳性样品和实际的鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒的序列100%同源，由此可知，将三重PCR检测方法应用其中，可以准确高效的完成检测，为后续的免疫治疗工作奠定良好的基础。