李 敏,王梓豪,严 丹,谢巧丽,撒亚莲,贺继刚

0 引 言

有研究证实，过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)分泌的外泌体 (BMSCGATA-4-外泌体)可以促进BMSC向心肌样细胞分化并改善心肌梗死后心功能，并发现BMSCGATA-4-外泌体中miRNA-673-5p明显高表达[1]。因此，分析BMSCGATA-4-外泌体可能是修复心肌损伤的关键分子。基于此，本实验利用小鼠心肌梗死模型，通过尾静脉注射过表达miRNA-673-5p的BMSC分泌的外泌体48 h后，利用心脏彩超评估小鼠心肌梗死后心功能恢复情况，探讨分析BMSCGATA-4-外泌体改善心肌梗死后心功能的分子调控机制，为临床转化应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料DMEM/F12基础培养基(美国 gibco公司)，外泌体提取试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)，Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit(广州市锐博生物科技有限公司)，Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer(广州市锐博生物科技有限公司)，miRNA-673-5p mimic试剂盒、miRNA-673-5p inhibitor试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)，α-actin引物、CX43引物、Desmin引物、cTnT引物(invitrogen公司)、miRNA-673-5p(广州市锐博生物科技有限公司)，Tsc-1 抗体(abcam公司)，Erk1/2抗体(CST公司)，Mef2c抗体(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BMSC的分离、培养及鉴定全骨髓培养小鼠BMSC，胰蛋白酶消化传至第3代时采用CD11b的磁珠负选，去除造血祖细胞。继续传至第7代。取增殖至第7代BMSC，待细胞汇合达80%～90%时。而后按Cyagen Biosciences公司脂肪、骨、软骨分化说明书操作完成小鼠BMSC三系分化检测。

1.2.2 构建过表达GATA-4基因BMSC将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中，构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒。将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入小鼠BMSC并加入基因开启剂强力霉素，具体见参考文献[1]。

1.2.3 实验动物健康4周龄SPF级C57BL/6 小鼠25只，均为雄性，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(川)2015-030，饲养条件：温度(23±2)℃，湿度45%～55%，光照12 h，通风良好，所有动物的喂养、观察均按照非临床研究管理规范规定执行。……