彭艳红，吴东宁，滕丹，白光，王庆峰

1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.北京丰台右安门医院，北京 100069；3.辽宁何氏医学院，辽宁 沈阳 110163；4.辽宁中医药大学中西医结合学院，辽宁 沈阳 110032

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是消化内科常见疾病，为胃及十二指肠内容物反流入食管，最终引起的食管炎症性病变[1]。RE 可发生于任何年龄人群，成人发病率随年龄增长而升高。其发病机制有反流屏障受损、反流物侵蚀作用、胃排空障碍、幽门螺杆菌感染，以及炎症介导因子等。RE 中医病机可概括为肝胆失于疏泄，胃失和降，导致胃气上逆，上犯食管，其临床常见证型为肝胃不和[2]。疏肝利胆和胃方由半夏、黄芩、柴胡、枳实、蒲公英、砂仁、浙贝母、白及、白芷、茯苓组成，乃国医大师周学文所创，宗半夏泻心汤、小柴胡汤、四逆散、参苓白术散、乌贝散之义，辛苦同进，升降并用，补泻兼施，共奏疏肝理气、健脾和胃、降逆止呕之功。但其作用机制尚不明确。

目前，中药复方作用机制分析已由单一靶点或信号通路过渡到以网络药理学为代表的系统生物学和多向药理学研究[3]。通过生物信息学手段，可对复方的物质基础及作用分子靶点进行网络融合，并进一步应用数据库工具探索复方的起效机制。然而，网络药理学研究大多通过分析多成分-多靶点网络作用关系探讨复方的整体作用[4-5]，虽然符合中医的整体观念及辨证论治特性，但对复方中重要药对的配伍关系分析不足。因此，如何应用现有技术对复方内的药物组成关系进行深入研究，并进一步考察组方的配伍关系，是网络药理学处理复杂复方的难题之一。为此，本研究除采用网络药理学方法对疏肝利胆和胃方进行数据挖掘外，应用主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）考察方中药味之间的相互关系，并进一步分析复方作用的核心分子靶点，预测疏肝利胆和胃方治疗RE 的物质基础及机制，以期为同类研究提供方法学参考。

1 资料与方法

1.1 疏肝利胆和胃方相关数据集采集与处理

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）检索疏肝利胆和胃方中各药物的化学成分及对应分子靶点。遵照Lipinski 规则对所获得的化学成分进行筛选，筛选条件[6]:①分子量（MW）＜500；②脂水分配系数（Alog P）≤5；③氢键供体数目（Hdon）≤5；④氢键受体数目（Hacc）≤10。获得疏肝利胆和胃方的主要化学成分。利用Excel2016 整理上述有效成分对应的分子靶点信息，建立药物（横坐标）-分子靶点（纵坐标）数据集，该数据集内的数值为药物作用不同分子靶点的重复值。

1.2 疏肝利胆和胃方药物聚类描述

①采用 Omicshare3.0 软件（ https://www.omicshare.com）对所得数据集进行PCoA:依据方中各药物对应的分子靶点重复值，统计各分子靶点的集中度。②采用Omicshare3.0 软件对所得重复值信息制作关系距离热图（bray 算法），并根据热图色块的变化情况分析方中各药物分子靶点的集中度关系。③以Omicshare3.0 软件对获得的各药物集中度差异情况制作PCoA 图，最终确定各药物之间的相互关系。④对“1.1”项下全部药物作用的分子靶点重复总值排序，取前50，将其定义为核心分子靶点。应用TBtools V0.66 软件的Heatmap 包对上述靶点的重复值做均一化处理后，制作热图，以考察上述核心分子靶点在各药物内的分布情况，确定各味药在疏肝利胆和胃方内的权重。

1.3 反流性食管炎背景网络构建

①通过CTD 数据库（http://ctdbase.org/）[7]筛选RE 相关的分子靶点:在“Diseases”搜索框中输入“reflux esophagitis”，获得RE 的分子靶点信息，并将其定义为RE 背景网络。②考虑到RE 背景网络内的靶点信息较多，以相关性系数（inference score）＞20及参考文献数量（reference count）＞10 对RE 的背景网络进行筛选，获得RE 核心背景网络。

1.4 疏肝利胆和胃方治疗反流性食管炎潜在靶点及功能富集

①以“1.1”项下疏肝利胆和胃方对应的分子靶点对“1.3”项下RE 背景网络及RE 核心背景网络分别进行映射，获得疏肝利胆和胃方治疗RE 的潜在靶点，综合“1.1”项下方中各药物有效化学成分信息，应用Cytoscape3.7.2 软件对映射所得靶点构建“药物-有效成分-分子靶点”网络及“药物-有效成分-核心分子靶点”网络。②以“1.2”项下核心分子靶点对上述网络进行映射，获得疏肝利胆和胃方治疗RE 的潜在核心靶点。③应用 WebGestalt 数据库（http://www.webgestalt.org）[8]及Cytoscape3.7.1 软件的ClueGO 包，对①中获得的核心分子靶点分别进行GO 功能富集和KEGG 通路富集，以确定疏肝利胆和胃方治疗RE 的分子机制。

2 结果

2.1 疏肝利胆和胃方主要成分作用靶点

经TCMSP 数据库检索及数据筛选，共获得疏肝利胆和胃方中10 个药物的369 个有效成分，删除重复值后，共获212 个唯一有效成分。有效成分及靶点分布情况见表1。

以相关性系数＞20、参考文献数量＞10 对RE 背景网络进行筛选，获得73 个靶点。以上述73 个分子靶点及“2.1”项下获得的药物、有效成分及分子靶点数据库的分布情况，构建“药物-有效成分-核心分子靶点”网络，见图4。可知，疏肝利胆和胃方作用于RE 核心分子靶点的药物仍以半夏有效成分最多（38个），另有蒲公英（2 个）、砂仁（1 个）、枳实（1 个）及黄芩（1 个），其他药物并未出现在该网络中，提示这5 种药物为疏肝利胆和胃方治疗RE 的核心药物，其中以半夏最为重要。该网络内17 个分子靶点的平均度值为5.65，共有11 个分子靶点大于平均度值。同时，以上述靶点对“2.2”项下筛选出的50 个核心靶点进行映射，最终得出疏肝利胆和胃方治疗RE 的核心靶点为PTGS2 及BCL2L1。

2.4 疏肝利胆和胃方对反流性食管炎的治疗机制

对图4 筛选出的17 个靶点进行GO 功能富集和KEGG 通路分析，结果见图5、图6。可知，疏肝利胆和胃方对RE 的治疗机制主要集中于炎症反应抑制，涉及NF-κB 通路、TNF 通路、IL-17 通路、花生四烯酸代谢通路、FoxO 通路和PI3K-Akt 通路等多条炎症通路；而AMPK 信号通路主要调节食管的能量代谢。上述结果表明，疏肝利胆和胃方可通过一系列信号通路，多角度、多靶点缓解RE 的发生和发展。

图4 疏肝利胆和胃方治疗RE 的药物-有效成分-核心分子靶点网络

图5 疏肝利胆和胃方治疗RE 核心靶点KEGG 通路富集

图6 疏肝利胆和胃方治疗RE 核心靶点GO 功能富集

3 讨论

疏肝利胆和胃方舒肝利胆、降逆止呕。现代药理学研究表明，方中半夏可抑制呕吐中枢[9]，黄芩、柴胡可抗炎镇痛[10-11]。目前针对该方组成药物治疗RE的研究多集中于半夏。郭震浪等[12]关于半夏泻心汤治疗RE 的Mate 分析显示，与西药比较，半夏泻心汤可有效提高RE 的临床疗效。另外，半夏厚朴汤、小半夏汤等方剂治疗RE 效果也较佳[13-14]。然而，现有研究多集中于疗效观察，对其治疗机制研究较少。

为理清疏肝利胆和胃方的作用机制，本研究尝试应用PCoA 考察组方药物之间的配伍关系。由分析结果可知，君药半夏与臣药白芷、砂仁关系较为密切，而另一君药黄芩与臣药柴胡、枳实关系较为密切。推测上述两君药分别与四臣药构成不同的功能模块。半夏模块以消痞散结为主，白芷、砂仁理气效果好，可配合半夏消痞；黄芩清胃经、胆经湿热，配合柴胡、枳实入肝经，进一步疏肝解郁。茯苓利水渗湿，加速肝胆湿热排出，与其他药物的功效有较大差异，因此在PCoA 图中距离其他药物的聚类靶点较远。由上述结果可知，PCoA 配合网络药理学对复杂方剂进行研究从技术上是可行的。

本研究获得的“药物-有效成分-分子靶点”网络中，黄芩素、没食子酸、6-姜烯酚、β-榄香烯及咖啡酸等自由度较高，然而，上述几个潜在有效成分并无针对RE 的相关报道。黄芩素作为自由度最高的有效成分，其有较好的抗炎活性。高东等[15]研究表明，黄芩素可直接降低胃溃疡模型大鼠血清丙二醛、三叶因子1、三叶因子2 及胃黏膜前列腺素E2、表皮生长因子的表达，可将其视为疏肝利胆和胃方的重要有效成分。与黄芩素类似，没食子酸[16]、6-姜烯酚[17]等成分多以抗炎作用起效。

在“药物-有效成分-核心分子靶点”网络中，自由度较高的分子靶点分别为PTGS2（前列素内环氧化物合成酶2）、TP53（肿瘤蛋白53）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、CASP9（半胱氨酸蛋白酶9）、BCL2L1（人BCL2 样蛋白1）、RELA（细胞核因子κp65）、BCL2（B 淋巴细胞瘤2）、BAX（促凋亡因子）、TNF（肿瘤坏死因子）等14 个靶点。其中，PTGS2 及BCL2L1 被定义为疏肝利胆和胃方治疗RE 的核心分子靶点。PTGS2 也称为环氧合酶-2（COX-2），其过表达可增加局部组织前列腺素的合成，刺激炎症反应。作为炎症疾病，RE 患者食管黏膜PTGS2 表达水平与食管远端酸暴露呈正相关[18]。作为重要的抑癌因子，TP53 与食管癌的关系被广泛报道[19]，其下游蛋白p53 与RE 的发病关系极为密切:p53 往往与食管黏膜暴露、细胞增生加速相关，而过度的酸碱刺激会进一步上调p53 的表达[20]，因此，抑制TP53 可有效阻遏下游蛋白的表达，起到缓解细胞增生的作用。Casp9 及Casp3 是疏肝利胆和胃方治疗RE 的重要调节分子靶点，Casp9 是Casp3 重要的上游蛋白。程静等[21]研究表明，Casp3 下调与胃黏膜的损伤程度密切相关。随RE 诱发的炎症反应，Casp3 下调会抑制凋亡通路，导致食管上皮鳞状细胞异常增殖（癌变的前兆）[22]。另一方面，RE 的炎症损伤会介导Casp3 过表达，诱导胃黏膜细胞的凋亡。作为Caspase 通路的上游信号因子，靶点Bax、Bcl2 及Bcl2L1 的分子功能主要是通过调控下游的Casp3 介导后续的细胞凋亡程序[23]。与上述3 个靶点类似，TNF 可通过TNF→TNFR1 的结合，激活FADD 形成Casp8 和Casp10 的前体，并进一步激活下游的Casp8 和Casp10；通过AKT→Bad 通路生成Casp9，并与Casp8 和Casp10 生成Casp3 前体，介导后续的凋亡程序[24]。RELA 是重要的炎症调控蛋白，虽然尚无其与RE 相关性的报道，但RELA 在多种炎症疾病中的上调趋势与炎症的病变程度正相关[25-26]，提示RELA 是抑制RE 炎症反应的重要靶点。综上可知，疏肝利胆和胃方可通过调节上述分子靶点实现对RE 的治疗作用。

从分子靶点的KEGG 通路富集结果可知，疏肝利胆和胃方治疗RE 涉及NF-κB 通路、TNF 通路、AMPK通路、IL-17 通路、花生四烯酸代谢通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路和胃酸分泌等。NF-κB 通路是调控大量炎症信号因子的信号中枢，可直接激活炎症反应[27]，该信号通路广泛参与细胞的炎症反应、细胞增殖、分化与凋亡，以及各类免疫反应；TNF 通路是其下游通路，在炎症反应的发生过程中发挥重要作用[24]。FoxO通路主要通过对下游NF-κB 及TNF 等通路的抑制实现其功能，祁永福等[28]研究显示，通过对FOXO4/NF-κB/TNF-α 炎症信号通路的调控，可以有效缓解RE 的炎症反应及食管损伤。PI3K-Akt 通路也是NF-κB 的上游通路，抑制PI3K/Akt 信号通路可减少多种炎症因子的释放，通过抑制该通路可有效减缓RE 进展[29]。白细胞介素（IL）-23 诱导IL-17 产生的细胞内信号传导通路，形成IL-23/IL-17 炎症轴[30]，其在许多慢性炎症及免疫系统疾病的发病过程中起关键作用[31]，而IL-17 信号通路也是RE 治疗的重要靶点[32]。疏肝利胆和胃方对IL-17 信号通路的抑制，可视为其对炎症反应抑制的重要机制之一。AMPK 信号通路与细胞能量代谢有关，在RE 发病过程中，随AMPK 信号通路的阻遏，细胞内生成的ATP 被过度分解，食管组织内ATP 不足以维持食管肌肉收缩所需，降低了括约肌压力，其抗反流的屏障作用随之减弱[33]。由上述结果可知，疏肝利胆和胃方治疗RE 的机制是对多条炎症通路的抑制，同时可调节食管细胞的能量代谢，最终保护食管。

RE 发生是多靶点共同作用的结果，伴随着相应的信号通路传导，最终实现其炎症反应，并导致相应的细胞损伤。本研究借助生物信息学手段对疏肝利胆和胃方进行分析，揭示了组方药物的作用关系及核心作用靶点，并进一步应用网络药理学手段，对该方治疗RE 的分子靶点进行分析，阐释了疏肝利胆和胃方治疗RE 的潜在作用机制。今后研究可针对上述靶点及通路进行验证，以确定疏肝利胆和胃方作用的确切分子机制。