韦婧 刘海洲 宁淑芳 张力图

【关键词】ITLN1;免疫;结肠癌;CIBERSORT

【中图分类号】 R735.35  【文献标识码】B 【文章编号】1002-8714（2020）05-0026-01

结直肠癌是世界第三大流行癌症，但死亡率排名第二[1]。结肠癌的发病机制涉及多种因素，包括环境和遗传变量，而详细的分子机制仍不清楚。非常需要特定的结肠癌生物标志物和治疗途径来改善患者的预后。

研究发现半乳糖凝集素在许多人类实体和血液恶性肿瘤中过表达，并在肿瘤生物学中发挥重要作用，包括转化，生长，粘附，侵袭和侵袭[2]。Intelectin 1（ITLN1）是最近发现的一种分泌型和半乳糖呋喃糖结合型凝集素，许多研究表明ITLN1与肠道免疫密切相关[3， 4]，肿瘤来源的半乳糖凝集素可能对肿瘤和免疫细胞产生双功能作用[5]。因此本研究重点探讨ITLN1对结肠癌的免疫功能的影响。

本研究对TCGA的表达谱数据进行分析，评估ITLN1基因在结肠癌的表达和预后，通过GSEA基因集富集分析寻找与ITLN1表达相关的调通通路和生物学功能，并使用CIBERSORT算法探索了ITLN1基因的表达与结肠癌组织中浸润的免疫细胞的相关性。

1 资料与方法

1.1数据获取

从TCGA数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）下载结肠癌患者的表达谱测序数据及临床数据。去除临床信息中生存时间缺失和生存时间小于30天的样本，比对临床和表达谱的样本去除不重合的样本，最后423个癌症样本和41个癌旁样本被纳入我们的分析。

1.2 差异表达分析及生存分析

我们从表达谱文件提取了ITLN1的表达值，R软件中的非参数检验wilcox.test来进行COAD组和正常组的差异性检验。根据ITLN1的表达值的中位数为界，将患者分为高或低表达两组，Kaplan-Meier（KM）生存分析被用于评估ITLN1基因表达对预后的影响。

1.3基因富集分析

为了鉴定ITLN1发挥的生物学功能，把表达谱数据按照ITLN1的表达量按上1/4与下1/4作为高低表达组，使用基于JAVA软件的GSEA v3.0来鉴定ITLN1的下游调控通路，设定显著性阈值P<0.05以及错误发现率（FDR）<0.25，基因集设为KEGG.SYMBOL.gmt。

1.4 CIBERSORT算法分析ITLN1基因与结肠癌的免疫相关性

采用CIBERSORT评估了ITLN1不同表达组中22种免疫细胞类型的组成，包括7种T细胞类型、幼稚和记忆B细胞、浆细胞、NK细胞和骨髓亚群。P <0.05时纳入分析。

1.5统计分析

生物信息学分析均使用R（v 3.5.1）软件进行，KM生存分析由“survival” R软件包完成。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ITLN1基因在结肠癌中表达显著降低

在TCGA数据库中，与相邻正常组织相比，ITLN1基因在结肠癌组织的表达水平降低（P <0.05;图1A）。进行 Kaplan-Meier分析，结果发现ITLN1表达较低的患者相比，ITLN1表达较高的患者生存时间显著延长（P<0.05;图1B）。

图1 ITLN1基因的表达和预后

2.2基因集富集分析

GSEA富集分析结果提示ITLN1基因高表达样本富集到造血细胞系、用于IGA生产的肠道免疫网络等免疫相关基因集（图2）。

图2 ITLN1的富集基因集和相关蛋白网络图

2.3 ITLN1表达水平与免疫细胞亚型的相关性

CIBERSORT分析结果发现ITLN1基因高表达组的浆细胞、静止的CD4记忆T细胞、M2巨噬细胞、嗜酸性粒细胞浸润程度明显增高，而M0巨噬细胞浸润程度明显降低（图3）。

图3 用于比较ITLN1基因高表达组和低表达组之间的免疫细胞比例的小提琴图

3 讨论    

一系列研究表明ITLN1在肿瘤发生的潜在作用。ITLN1通过调节肝癌细胞中Sirt1依赖性p53脱乙酰基作用促进细胞凋亡[6]。体内外实验发现，ITLN1通过失活磷酸肌醇3-激酶/ AKT / Ikappa B激酶信号传导来减弱胃癌细胞中抑制HNF4α表达的转录因子核因子-κB的活性，抑制胃癌的进展，ITLN1与胃癌患者的生存期延长有关[7]。此外，人ITLN-1和小鼠intelectin-1（mITLN-1）可能在针对所选微生物或外源抗原的防御中发挥免疫学作用[3]。本研究发现ITLN在结肠癌表达明显降低，是结肠癌的保护因子。

肠道某些细菌通过促进促炎性细胞因子（如干扰素-γ和白介素-17A）的产生而引发类似效应子的免疫反應，而其他细菌则促进调节性CD4 T细胞的产生，并有助于肠道稳态。微生物群对B细胞也有深远的影响。肠道微生物暴露导致B细胞库的持续多样化，并产生T依赖性和非依赖性抗体，尤其是IgA[8]。GSEA富集分析结果表明ITLN1参与多条免疫相关通路。我们推测ITLN1可能参与免疫调节，我们使用CIBERSORT，一种反卷积算法[9]评估ITLN1表达值组别与免疫细胞亚型之间的关联。结果发现ITLN1高表达时浆细胞、M2巨噬细胞浸润程度明显增高，而M0巨噬细胞浸润程度明显降低。本研究发现ITLN1可能是在将幼稚B细胞成熟成分泌IgA的成熟浆细胞中发挥作用，是维持肠道免疫稳态的关键因素之一。肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）是另一个非常重要的免疫种群，可促进或阻断肿瘤的发展。巨噬细胞不同亚型（M0，M1和M2）都具有不同的免疫功能。M2巨噬细胞参与Th2型免疫应答，抑制T细胞增殖和分化，并促进肿瘤细胞增殖和肿瘤基质的血管生成[10]。大量文献亦报道intelectins成员在炎症及免疫应答方面发挥重要调节作用[5， 11]。