包文龙，冯俊华，劳成景，谭蓓蓓

(广西农业职业技术学院，广西 南宁 530007)

木棉花(kapok), 别称英雄花、烽火 , 为我国南方特产木棉科木棉属植物木棉的花朵,主要分布在广东、广西、四川、云南等地区。其药性甘、淡，凉，具有清热解毒，凉血之功效[1]。民间常将其晾干后泡水服用或煲汤食用。广东等地生产的五花茶凉茶，由木棉花与金银花、菊花、鸡蛋花、槐花配制而成，深受消费者喜爱。木棉的花大而美，树姿巍峨,极具观赏价值，成为南宁市道路和园庭绿化环境的优良观赏树种。但是每年大量落花被作为废弃物处理实则可惜。

近年来，国内外学者对木棉花化学成分和药理活性进行了大量研究，研究表明木棉花所含成分主要包括有多糖、黄酮类、苯丙素类及甾醇、脂肪酸和红色素等活性物质[2-4]。药理研究表明其生物活性主要有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗菌[7]及保肝[8]和抗肿瘤[9]等。本实验通过木棉花不同部位提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究探索木棉花的新功效，为木棉花落花资源的充分利用，作为天然药物的开发提供实验依据。

1 实 验

1.1 材料、试剂和仪器

木棉花，三月于广西农业职业技术学院内采摘；新鲜马铃薯，购自南宁市利客隆超市。

L-酪氨酸，Sigma公司；熊果苷，上海圻明生物科技有限公司；75%乙醇；二甲基亚砜(DMSO)；磷酸；磷酸氢二钠；浓盐酸；均为市售分析纯；D101大孔树脂，天津市海光化工有限公司。

T500型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；EL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TM-767(Ⅲ)搅拌机，中山市海盘电器有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TD-600台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任有限公司；DHG-9203A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学有限公司；VIS-7220N可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 木棉花的摘取及干燥

三月份在广西农业职业技术学院校园内摘取，整朵放入电热鼓风干燥箱干燥，得整朵干燥木棉花。分出花托、花瓣、雄蕊、带雄蕊花托等材料。

1.2.1.2 木棉花醇提物的制备

分别称取干燥木棉花花托、花瓣、雄蕊和干燥木棉花带雄蕊花托各 10.00 g，使用75%乙醇至电热恒温水浴锅上恒温回流提取1.5 h/次。共回流提取3次，合并三次提取液后进行真空抽滤，减压浓缩后真空干燥，得木棉花四部位醇提物。

1.2.1.3 木棉花水提物的制备

分别称取干燥木棉花花托、花瓣、雄蕊和干燥木棉花带雄蕊花托各 10.00 g，使用蒸馏水至电热恒温水浴锅上恒温回流提取1.5 h/次。共回流提取3次，合并三次提取液后进行真空抽滤，减压浓缩后真空干燥，得木棉花四部位水提物。

1.2.1.4 木棉花总黄酮的制备

称取干燥木棉花雄蕊10.00 g， 加适量石油醚加热回流脱脂1.5 h/次，将三次浸提液过滤弃掉，滤渣挥干残余石油醚后加入 75%乙醇至电热恒温水浴锅上恒温回流提取1.5 h/次，共回流提取3次，合并三次乙醇提取液后进行真空抽滤，所得滤液平分成两部分，一部分进行减压浓缩后真空干燥，即得干燥木棉花雄蕊总黄酮提取物；另一部分减压浓缩至料液比为1∶2后，分别使用30%和60%乙醇通过HPD-101大孔树脂进行洗脱分离。所得两部分洗脱液分别进行减压浓缩后真空干燥，既得木棉花30%乙醇浓度洗脱流份和60%乙醇浓度洗脱流份。

1.2.2 酪氨酸酶原液的制备

将去皮切碎经过预冷的马铃薯与预冷的磷酸钠缓冲液，按照固液比 1∶1 (w∶v)的比例，加入搅拌机制成匀浆，用四层纱布过滤，收集滤液于离心机离心(4000 r/min)10 min，取上清液，即得酪氨酸酶原液，于-10 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 试剂配制

1.2.3.1 磷酸钠缓冲液

精确称取磷酸氢二钠1.0000 g，磷酸二氢钠1.0000 g，加入少量去离子水溶解后，定容于 500 mL容量瓶，保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.3.2 L-酪氨酸溶液

精确称取0.3400 g L-酪氨酸，于250 mL容量瓶中，先加入3～4滴浓盐酸，加适量去离子水，水浴微热使其完全溶解后，用氢氧化钠溶液调节L-酪氨酸溶液pH至7.0，加去离子水定容至 250 mL。

1.2.3.3 受试液

精确称取木棉花各部位水提物、醇提物及黄酮提取物各项各0.2000 g，分别溶于25 mL二甲基亚砜溶液中，即得到初始浓度为8.00 mg/mL的待测液，再分别稀释至4.00、2.00、1.00和0.50 mg/mL四个待测浓度。

1.2.3.4 阳性对照液

精确称取熊果苷粉末0.2000 g，溶于25 mL的去离子水中，即得到初始浓度8.00 mg/mL 的阳性对照母液，再稀释至4.00、2.00、1.00和0.50 mg/mL四个待测浓度。

1.2.4 样品对酪氨酸酶活性的抑制

用移液管按表1的体积向试管依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的木棉花提取物受试液、不同浓度梯度的熊果苷对照液和酪氨酸酶液，置于37 ℃水浴预混合10 min后，加入底物L-Tyr，反应15 min，迅速移入比色皿，测定在475 nm波长下的吸光值。每个浓度实验做3个平行，按照以下公式计算木棉花提取物对酪氨酸酶的抑制率：

抑制率=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]×100%

式中：A1为有酶无样品时的吸光度，A2为无酶无样品时的吸光度，B1为有酶有样品时的吸光度，B2为无酶有样品时的吸光度，C1为阳性对照品加酶时的吸光度，C2为阳性对照品无酶时的吸光度。

表1 反应液组成与体积

实验数据用EXCEL统计，组间对照进行T检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 木棉花醇提物对酪氨酸酶活性的影响

以L-酪氨酸为底物，考察木棉花花托带雄蕊醇提物、雄蕊醇提物、花托醇提物、花瓣醇提物及熊果苷对酪氨酸酶活性抑制作用，结果如图1所示。由图1可以看出各项样品对L-酪氨酸的酶促氧化进程均表现出抑制作用，且随着各受试液质量浓度的增加，抑制率也呈稳态增加趋势，表现为浓度依赖性抑制。其中以雄蕊醇提物和花托醇提物对酪氨酸酶的抑制作用最为明显，且抑制率高于同浓度的阳性对照组熊果苷的抑制作用(P<0.01)；而总醇提物在0.05 mg/mL时抑制作用优于熊果苷(P<0.05)其他浓度抑制率与熊果苷相当；花瓣醇提物各浓度抑制率远低于熊果苷(P<0.05)。在实验浓度范围内，木棉花醇提物对酪氨酸酶的抑制率高达78%。

图1 木棉花各部位醇提物和熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

2.2 木棉花水提物对酪氨酸酶活性的影响

图2 木棉花各部位水提物和熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

以L-酪氨酸为底物，考察木棉花花托带雄蕊水提物、雄蕊水提物、花托水提物、花瓣水提物及熊果苷对酪氨酸酶活性抑制作用，结果如图2所示。在实验浓度范围内，木棉花不同部位提取物对L-酪氨酸的酶促氧化进程表现出较弱的抑制作用在20%以下，除花托和花瓣水提物在0.05 mg/mL浓度时与阳性对照熊果苷的抑制率活性相当外，其余部位均明显低于熊果苷(P<0.01)。由此可见，木棉花的水提物中对酪氨酸酶起抑制作用的有效成分较少。

2.3 木棉花雄蕊总黄酮、30%流份、60%流份对酪氨酸酶活性的影响

以L-酪氨酸为底物，考察木棉花雄蕊提物总黄酮，及两种流份对酪氨酸酶活性抑制作用的，结果如图3所示。在实验浓度范围内，木棉花黄酮提取物对L-酪氨酸的酶促氧化进程均表现出明显抑制作用，均高于对照品熊果苷的抑制作用(P<0.01)。且随着浓度的增加，抑制率呈上升趋势，表现为浓度依赖性抑制作用，而60%流份在浓度达到0.20 mg/mL后，上升趋势缓慢且趋于平衡状态。其中雄蕊总黄酮的抑制率高达91%。

图3 木棉花雄蕊黄酮提取物和熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

由图1和图2可以看出，同种提取溶剂花托提取物对酪氨酸酶的抑制率高于其他部位提取物的抑制率。这是由于木棉花的主要抗氧化活性物质为黄酮类成分和酚酸类成分[10]，而花托的化合物种类和含量都高于花蕊和花瓣[11]。图3结果显示在浓度达到0.2 mg/mL后，30%流份的抑制率扔在显著上升且高于60%流份的抑制率，由于木棉花抗氧化活性成分复杂多样，在使用不同浓度的乙醇洗脱后，两流份的化合物成分及含量存在差异，因此存在对酪氨酸酶的抑制率差异，其成分和含量有待进一步研究。

3 结 论

酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一种氧化还原酶，广泛存在于植物、动物和人体中，是生物体合成黑色素的关键酶。在人体中，主要存在于皮肤表皮细胞的黑色素细胞中[11]。黑素的生物合成是由酪氨酸酶催化体内L-酪氨酸(L-Tyr)生成多巴，多巴进一步氧化成多巴醌 ,多巴醌再经一系列化学变化 ,最后产生黑色素的过程[12]。研究表明酪氨酸酶的活性与黑素合成量相关，控制其活力即可控制黑素生成量[13]。因此，研究天然提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用，对开发抑制黑色素生成进而达到美白皮肤效果的天然植物化妆品具有重要的意义。

本实验以目前美白化妆品中应用最广泛的熊果苷作为阳性对照品，使实验更具参照性。本文研究得出以下结论：

(1)木棉花提取物对酪氨酸酶活性抑制作用以醇提物为主，表明主要活性成分存在于乙醇提取物中。

(2)木棉花提取物不仅对酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且对酪氨酸酶活性的抑制效率呈剂量依赖性关系。

(3)同一提取溶剂木棉花花托部位的提取物对酪氨酸酶活性的抑制率均高于雄蕊、花瓣的提取物，在实验浓度中花托醇提物的抑制率高达78%，且优于阳性对照熊果苷的抑制率(P<0.05)。

(4)木棉花雄蕊总黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制作用最为显著，各实验浓度均高于同浓度的阳性对照组熊果苷的抑制作用(P<0.01)，且实验浓度范围最高抑制率可达91%。

(5)在使用30%乙醇和60%乙醇两种不同浓度洗脱液进行总黄酮流份制备，所得30%流份对酪氨酸酶活性的抑制率高于60%流份的抑制效果，通过查阅资料得出此结果可能是由于木棉花的抗氧化活性成分复杂多样有关，此结果有待进一步研究。

(6)当前化妆品中所用的美白成分，绝大部分以酪氨酸酶抑制剂为主，木棉花来源广泛，其在民间和凉茶应用极为广泛，是药食两仪的植物，且廉价易得，是一种极具市场开发潜力的天然酪氨酸酶抑制剂。