王天强，周林宗，王紫荆，王江鹏，王子敬，张 伟，田海燕

（楚雄师范学院，云南 楚雄 675000）

随着人类社会、经济的发展，人口数量的增多，能源需求量也愈来愈大。煤、石油、天然气作为不可再生的化石能源，大部分已被开采。能源短缺、急切需要加快寻找绿色清洁能源的步伐。生物柴油是新型清洁能源，不会像化石燃料一样面临枯竭，且燃烧后对环境的污染小。目前世界各国把目光聚集在生物柴油的研发上，生物柴油势必将成为新能源开发的新趋势［1］。

生物柴油是通过动物、植物体油脂等和醇类在酸或碱催化剂下反应得到［2］。传统油料作物因其产量低、成本高、与农作物争地、受季节性影响高等缺点不宜大规模应用。微藻是一种生长在自然水体和土壤中的单细胞生物，生长迅速、繁殖快、可以利用污水内成分生长，是理想的生物柴油替代品［3］。

1 微藻研究发展历程

直到目前为止，自从微藻生物能源概念的提出和发展，微藻已成为污水处理行业的热门研究对象，在微藻工艺、设备、及机理方面已有许多成果。

1）微藻研究发展历程。美国麻省理工学院的研究学者于1950年在校园内建筑物的屋顶开始进行养殖藻类生产生物燃料的试验，并在研究中第一次提到微藻生物能源概念；之后，Oswald等1957年提出了利用微藻来处理污水中的氮磷等营养物质［4］，这为藻类应用于污水处理奠定了基础。Mcgriff等在1971年提出了“活性藻”的概念，顾名思义，把活性污泥和藻相结合，然后微藻处理污水的方式便和活性污泥处理污水的方式相同，结果表明，这种方式可以去除污水中92%的氮和94%的磷［5］。受第一次石油危机的影响，美国能源部可再生能源国家实验室于1978年启动了水生物种项目研究，该项目历时19年、耗资2505万美元，且项目筛选出300余种产油藻种，重点开发适于微藻生物柴油生产的培养系统和制备工艺。直至20世纪90年代，日本国际贸易和工业部投资资金25亿美元，用于支持 “地球研究更新技术计划”，着力开发密闭光合生物反应器技术，利用微藻吸收火力发电厂烟气中的二氧化碳，将之转化为有机能源生物能源；90年代后期油价大幅下降，微藻能源研究处于停滞状态。21世纪以来微藻以其独特的优势，重新成为研究的热点，并作为污水处理及能源行业研究的重点。

2）微藻利用研究。20世纪50年代以来，国内外研究学者证明了微藻是海洋中的主要初级生产者，是海洋生态系统和食物链的基础，且驱动着整个海洋生态系统的能量流动和物质循环，在海洋生态系统的物质循环中起着不可替代的作用。如Tam等利用小球藻对模拟生活污水进行脱氮除磷处理，结果表明，悬浮态小球藻对氮磷的去除率分别为40%和59%，而固定态小球藻对这两种物质的去除率达到了78%和94%［6］。此外，有研究表明固定化藻类可以回收污水中的重金属，如Cu2+、Zn2+、Hg2+、Au3+等离子［7］。

微藻净化污水具有较好的效果，目前对微藻净化污水的机理的研究也较多，主要从脱氮除磷和吸附重金属两方面进行研究。污水中的各种含氮化合物是微藻自身生长繁殖所需的氮源，CO2和碳酸盐等无机物作为碳源，在光照作用下进行自养生长，微藻吸收转化后的化学物质用于合成微藻自身的氨基酸、蛋白质、其他细胞结构等［8-9］。

2005年，随着生物能源发展，国外第一辆采用海藻燃料和大豆油（调合体积比为1∶9）为能源的示范轿车在印度完成实验，并实现了1500km的里程，打开微藻生物能源在交通运输中的开端。紧跟脚步，2007年美国国际能源公司启动了“海藻变油”的研发计划，通过海藻的光合作用来生产可再生柴油和喷气燃料。而应用于航天的生物柴油，也随着Solazyme等人利用异养法养殖高含油微藻研究变为现实。

3）微藻利用机理研究。污水中的磷酸盐可以通过直接吸收或通过磷酸化途径转化成ATP，或者以磷酸盐的形式沉淀［10］。微藻的培养不仅仅是培养出生长速度快，环境适应能力强的微藻，更重要的是对微藻工程利用的机理加以探索，实现微藻的污水生物处理，体现理想的经济、环境和社会效益。目前对于微藻的诱变、选育以及产脂性能研究方面关注度较高，并且成果显著［11］。

4）我国微藻固碳研究与生物能源技术研究较之国外起步较晚，但后期厚积爆发，取得不菲的成绩。目前，在高产油藻种的选育与改造、高效微藻光反应器、高密度培养、高效加工等技术研究［12］方面有了显著进步。

目前，微藻在分子生物学研究、污水处理工艺研究、脂肪积累机理等研究方面关注度较高，研究成果丰富。但是随着环境问题的突出，是否导致微藻资源的变化，如种类和数量方面的变化，该方向值得深入研究。另一方面微藻资源的调查分析与种质资源保存方面研究具有重大意义，种质资源的保存有助于我们了解环境变化对生物的影响，为未来微藻研究积累资源。

2 微藻分离技术及流程

微藻分离指的是通过环境取样，采集含有微藻的样品（如水样、土壤样品等），通过适宜的培养基，经过前期微藻富集增加微藻数量，再进行微藻的分离工作，最终获得纯种微藻的过程。

2.1 微藻样品采集

微藻种类繁多，适用能力极强，水环境中的淡水和咸水，以及土壤环境（一般土壤和沙漠土壤）均有微藻的分布，不同环境内微藻样品采集方式有所差异。

1）水环境微藻样品的采集。淡水环境微藻水样采集常用分层取样的形式，采用水质取样器采集不同深度水样，水样采集后存放于无菌采样瓶中［13］，现场测定温度等部分水样常规指标，其他指标带回实验室测定。海水样品的采集主要指海洋水样的采集，采集后置于采样瓶中带回实验室进行后续试验［14］。水环境样品采集时除了采集水样外，水体沉积物也需进行采样，如湖泊沉积物、海洋底泥等，用采样铲子将样品标本收集于取样袋内，带回进行微藻的分离培养。

2）土壤环境微藻样品的采集。选取环境中含微藻的取样点，用铲子小心采集土壤表面层及其至10cm深处土壤，沙漠土壤样品采集带回实验室后直接用于后续分离培养试验［15］，收集于密封袋中带回实验室的样品，可在黑暗、室温条件下保存［16］。

2.2 微藻培养基选择

由于采集带回实验室的样品内含有多种微生物，如细菌、真菌、原生动物等，快速、定向富集微藻需要优选适宜的培养基，常见的培养基有SE培养基、BG11培养基、f／2培养基、D1培养基、BBM培养基、TAP培养基和MA培养基，各培养基用途及适宜微藻类型如表1。

表1 微藻分离常用培养基

培养基为微藻的生长提供碳源、氮源、水和各类无机生长因子，因此在对未知微藻进行分离培养时，可对培养基的成分进行适当调整，以适应微藻研究需求。

这种突破性贡献，也让她个人取得无上殊荣——成为人类历史上第一个两度获得诺贝尔奖的人，各种奖金与头衔更是不胜枚举。

2.3 微藻富集过程

微藻富集指的是利用适宜培养基，将采集微藻样品接种于培养基内，一方面快速增加微藻数量，另一方面抑制其他生物的生长。常见加速富集速率的方法有样品预处理、培养基的优化［21］、抑菌方案的筛选［22］和培养条件设计。

采集回实验室的样品首先进行微藻的显微镜检测，若微藻数量较高，则直接进行微藻分离，否则将采取富集培养的方式。在富集培养之前，需对水样进行预处理，如去除大的砂石和土壤颗粒、水样进行初步过滤，去除非目标生物等。

培养基优化，淡水培养基常用BG11和SE，但是培养基的pH值和培养条件可进行优化，甚至可在培养基内加入土壤浸提液或者原位灭菌的水样。如响应曲面法优化后的BG11培养基适宜于养猪废水内刺链带藻的生长［23］，研究学者优化后的培养基可作为微藻富集分离培养基。

抑菌方案的设计，抑菌方案主要通过培养基设计，如培养基内缺少C源且光照培养可定向培养光能自养微藻，进行黑暗培养条件下培养能够筛选异养生长的微藻，寡异养培养基可抑制大部分微生物的生长，加入抗生素可抑制微生物的同时定向筛选微藻［22］。

微藻培养条件的不同，将微藻培养方式分为光照培养和黑暗培养，不同微藻的生长类型不同，需要进行相应调整。常见微藻培养条件为21～25℃、光暗周期为 12h，如月牙藻［24］、小球藻［25］和栅藻［26］等的培养。除此以外，光暗比 14∶10 h、16∶8 h、全光照和无光照［22］等条件也在微藻筛选中被应用。培养至富集微藻液体颜色发生显著变化时，取部分样品进行显微镜检测，目标微藻成为优势藻并且达到分离浓度即可进入下一步微藻分离的过程。

2.4 微藻分离技术

2.4.1 平板分离技术

微藻培养过程中若改变pH条件，以及减小凝固剂对微藻的影响，可将琼脂换为结冷胶，以提高纯化效果。另外，在纯化过程中，为了适用不同微藻类群，也可采取半固体培养基进行微藻的分离试验。

2.4.2 细胞培养板分离技术

该方法原理为稀释分离法，将微藻富集液稀释至适宜浓度，直至每一份样品内仅含有单个微藻细胞时，对单个微藻细胞进行培养。如微藻细胞培养板分离技术，该方法将富集藻液进行稀释，稀释至1～10滴稀释液内仅含有一个微藻细胞为止，然后在96孔细胞培养板每个培养孔内加入1滴稀释液，并再加入无菌培养液，放置于培养箱内培养，培养7d后用倒置显微镜观察微藻生长情况，用无菌滴管吸出藻液进行扩大培养，即可获得纯种微藻藻株。

2.4.3 单细胞吸取技术

该方法通过一定的仪器和设备直接取出富集液内的特定微藻细胞，对单个细胞进行独立培养，常见的有显微操作技术，流式细胞仪技术。显微操作技术指的是在显微镜下找到单个的微藻细胞，用毛细管玻璃针吸取单个细胞，放于培养液内单独培养，该方法可快速获取纯种微藻细胞。

流式细胞仪辅助技术可以对细胞快速检测、识别与分选，通过前期对微藻的富集培养，提高微藻数量，然后采用流式细胞仪进行微藻种类的检测，并实现定向高效分选微藻，获得纯种微藻藻株。

3 微藻鉴定技术

3.1 形态鉴定

前期分离的纯种微藻，用接种针挑取少量于载玻片上，加盖玻片后显微镜观察，在高倍镜下记录其显微形态与颜色。微藻显微镜观察前可采用鲁格氏液固定［27］、结晶紫染色［28］等方式让微藻形态更为明显。根据观察到的形态，参考《中国淡水藻类-系统、分类及生态》对微藻进行初步分类鉴定。此外可配合扫描电镜对微藻细胞表面形态进行观察，加强显微鉴定的准确性。

3.2 分子鉴定

分子鉴定技术通过对微藻的18 SrDNA测序和比对，实现种群的鉴定。具体操作方法为：首先将纯种高浓度藻液离心收集微藻细胞，采用CTAB、试剂盒等法提取微藻DNA，获得高纯度DNA；其次对微藻18sr DNA设计引物［28］，设计适当的PCR反应程序，对目标片段进行扩增；扩增片段的测序，由序列测序公司完成（如上海生工、华大基因等）；测序完成片段去除两段无效片段，将中间片段输入NCBI内进行比对，选取相似性较高的数据库已知微藻DNA序列，与目标序列采用MEGA等软件进行聚类分析，分析目标微藻的种群聚类，最终实现微藻的鉴定，若相似性低于97%，则可判断为新种微藻［28］。

4 富油微藻筛选技术

分离鉴定的微藻需快速检测其油脂含量，或者从大批量微藻中筛选出富油微藻，采用尼罗红染色是较为迅速的检测手段，使用尼罗红对微藻进行染色，以三油精为标准品，绘制标准曲线，480nm为激发波长，580nm为吸收波长测定荧光值，根据荧光值测定油脂含量［28］，快速筛选富油微藻的尼罗红染色法、是一种很好的初级筛选方法。此外，总脂含量的索氏提取测定方法［29］、乙酸乙酯／正己烷混合溶剂萃取法［30］，脂肪酸的 GCMs测定方法［31］均能够对微藻油脂检测，实现富油微藻的筛选。通过藻种比生长速率、生物量以及油脂含量的测定，建立了优良藻种的综合评价方法［32］。

5 微藻发展趋势

随着国内化石燃料的大量消耗，生物柴油，尤其是微藻生物能源的开发异常迅速。目前对微藻的开发主要集中在富油微藻的筛选与育种、微藻生物柴油的工业生产与开发。在前期微藻筛选阶段，由于自然环境微藻资源的丰富性，每年都有新种微藻被发现，甚至部分微藻在人工培养条件下难以获得纯种的藻株。因此，开发新的微藻筛选工艺、新的微藻培养方法、新的微藻保存措施等可有效加速微藻资源的探索与开发。甚至通过微藻资源的调查，将微藻在生物能源、食品、医疗、化妆品、化工等等诸多领域开拓。