唐 娜，杨 慧，刘 磊，张松林，于 雪，孙培姣，沈志强,，肖跃强

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州256600；2.山东绿都生物科技有限公司，滨州256600）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病为特征的接触性传染病，是世界范围经济危害最为严重的猪病毒传染性疾病之一，每年导致美国养猪行业损失约6.64亿美元[1]。该病1987年在美国首先被报道，20世纪90年代传入我国并广泛流行[2]。从最初的经典型PRRSV流行到2006年暴发的由高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）引起的“猪高热病”（农医发[2007]10号），再到近几年开始流行的类NADC-30毒株引发的PRRS，以及病毒自然重组导致的变异毒株等，该病严重危害了我国养殖业的健康发展[3-8]。

PRRSV是动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）成员，基因组约为15.4 kb的单股正链RNA，包含至少10个开放阅读框（open reading frame，ORF），侧翼为5'端和3'端非翻译区（untranslated region，UTR），且3'端有poly（A），具体组织结构为：5'UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF3-ORF4-ORF5/ORF5a-ORF6-ORF7-3'UTR。ORF1a和ORF1b编码的2个多聚蛋白通过病毒酶解离产生14个非结构蛋白[9]；ORF2至ORF7编码8个结构蛋白：GP2、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N[10]，由一系列嵌套的亚基因组mRNA表达（subgenomic mRNA，sg mRNA），sg mRNA是在转录调节序列（transcription-regulating sequences，TRS）引导下，来源于病毒转录期间负链RNA的不连续合成[11-13]。PRRSV感染性克隆可作为表达载体，在TRS的控制下，外源基因可以作为单独的转录单位实现表达，构建病毒载体疫苗[14-17]。

本研究首先构建了PRRSV XZ06株[18]传代致弱毒株XZ06a感染性克隆，并以此为骨架引入ORF6 TRS与酶切位点，克隆插入增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP），拯救获得了能够表达EGFP的重组PRRSV，为开展病毒感染致病机制、重组疫苗构建等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要病毒株、菌株、载体 PRRSV XZ06a株、Marc-145细胞、pEGFP-C1、pCAGEN载体、大肠杆菌感受态细胞DH5α等由山东省滨州畜牧兽医研究院重点实验室保存。

1.2 主要试剂 Lipo 2000、Opti-MEM、SuperScriptⅢ反转录酶、Phusion Flash High-Fidelity PCR Mix、PageRulerTM预染蛋白marker、GeneJET Viral DNA/RNA提取试剂盒、GeneJET Plasmid小量制备试剂盒、GeneJET Gel Extraction试剂盒、β-actin mAb、GFP Tag mAb、HRP标记Goat anti-Mouse IgG、HRP标记Goat anti-Rabbit IgG等购自Thermo Scientific公司；DL15 000、DL2000 DNA marker、pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；各种限制性内切酶、T4 DNA Ligase购自NEB公司；针对PRRSV M蛋白单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蔡雪辉研究员惠赠。

1.3 引物设计与基因合成

1.3.1 PRRSV XZ06a感染性克隆构建引物 根据PRRSV JXA1株（EF112445）基因组序列，将基因组分为F1～F4共4段进行克隆。改造pCAGEN载体多克隆位点EcoRⅠ与NotⅠ之间序列为5'-SmaⅠ-AfeⅠ-NheⅠ-AscⅠ-PmeⅠ-3'序列，即序列为MCS-1/2，改造后命名为pCA，并利用EcoRⅠ与SmaⅠ插入锤头样核酶序列（HHRz），同时人工合成HDVRz。引物均使用Primer Premier 5.0软件辅助设计，引物与基因均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

1.3.2 表达EGFP重组PRRSV感染性克隆构建引物 选择PRRSV XZ06a基因组ORF1b与ORF2之间（11 981 nt～11 983 nt），插入ORF6 TRS序列，同时选择基因组NheⅠ（7608 nt）与EcoRⅤ（12 072 nt）区段，经PCR扩增、基因组外拼接、基因组替换等引入酶切位点PacⅠ与MluⅠ，构建含有PacⅠ与MluⅠ酶切位点感染性克隆，然后以pEGFP-C1模板，PCR克隆EGFP基因，并插入对应酶切位点，构建携带EGFP基因的病毒感染性克隆。引物同样使用Primer Premier 5.0软件辅助设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

1.4 病毒基因组提取与cDNA合成 根据GeneJET Viral DNA/RNA提取试剂盒说明书提取病毒基因组RNA，溶于DNA/RNAase free水，75℃水浴变性5 min，冰浴条件下，依次加入Oligo(dT)18、Random Hexamers、反转录酶Buffer、dNTP、Rnasin、SuperScript Ⅲ反转录酶，50℃反应60 min合成cDNA，95℃加热5 min灭活。

1.5 病毒基因组PCR克隆 使用Phusion Flash高保真PCR预混液扩增病毒基因组，扩增条件为：98℃预变性10 s，98℃变性1 s，根据引物选择53℃～57℃退火5 s，72℃延伸30 s～90 s（1 kb/15 s），共30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.6 感染性克隆构建策略 以合成HDVRz为模板，引物3-HDV-F/R克隆后与F4搭桥扩增获得携带HDVRz的F4-HDV；根据改造的多克隆位点与基因组序列酶切位点分布，感染性克隆构建插入顺序依次为F1、F2、F4-HDV与F3，构建的感染性克隆命名为pCA-XZ06a。

1.7 酶切位点引入与携带EGFP基因感染性克隆构建引物对XZ11983TRS-F（融合PRRSV ORF6 TRS序列）、XZ12101-R与XZ7594-F、XZ11982-R分别扩增基因组，依次克隆入pMD18-T，引入了PacⅠ与MluⅠ克隆位点，经NheⅠ/EcoR Ⅴ双酶切后替换PRRSV XZ06a感染性克隆对应区段，构建携带酶切位点的感染性克隆，引物XZ11520-F/XZ12753-R扩增，PacⅠ/MluⅠ分别酶切鉴定扩增产物，并将鉴定正确的克隆命名为pCA-XZ06∧；以pEGFP-C1为模板，PCR方法克隆EGFP基因，进行PacⅠ/MluⅠ双酶切，插入携带酶切位点的感染性克隆，构建携带EGFP基因的感染性克隆，命名为pCAXZ06a∧EGFP。

1.8 重组病毒的拯救 提取pCA-XZ06a、pCAXZ06a∧、pCA-XZ06a∧EGFP重组质粒，测定浓度，质粒转染剂量为1 μg/孔，转染介质为Lipo 2000，二者比例为1∶5（W∶V），具体操作按照转染试剂说明书进行。转染48 h后，每日观察细胞病变，同时荧光显微镜观察EGFP荧光，确定病毒是否拯救成功。

1.9 重组病毒EGFP的表达检测 收获感染Marc-145细胞5、8、16、24、48 h时间点重组病毒，进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，以针对PRRSV M蛋白单克隆抗体、Anti-GFP mAb的单抗分别为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测，化学发光收集酶促反应信号。

1.10 重组病毒的增殖与噬斑纯化 待细胞出现CPE比例60%以上时收获，反复冻融3次，传代培养，表达EGFP重组病毒每传3代进行克隆纯化，连续纯化3次，持续传代，并测定第10代重组病毒滴度TCID50。

2 结果

2.1 PRRSV基因组克隆 基因组PCR扩增结果如图1所示，成功克隆了PRRSV XZ06a全基因组，所克隆的F1～F4段产物大小分别为2213 bp、5493 bp、4345 bp与3460 bp，与预期一致。

2.2 PRRSV XZ06a感染性克隆构建 测序证实pCA改造载体EcoRⅠ与SmaⅠ之间成功插入HHRz序列，然后XhoⅠ（HHRz序列引入）与AfeⅠ双酶切克隆插入F1片段，AfeⅠ/NheⅠ双酶切插入F2片段，AscⅠ/NotⅠ双酶切插入F4-HDV片段，最后NheⅠ/AscⅠ双酶切插入片段F3，测序结果显示，正确构建了DNA-launched感染性克隆pCA-XZ06a。

图1 PRRSV XZ06a株基因组扩增结果Fig.1 Amplification products of PRRSV XZ06a strain genome

2.3 酶切位点引入与基因组置换 引物XZ11983TRS-F（融合PRRSV ORF6 TRS序列）与XZ12101-R、XZ7594-F与XZ11982-R分别扩增获得预期为158 bp、4388 bp产物，电泳结果见图2、3；依次克隆入pMD18-T，并经测序鉴定成功引入酶切位点PacⅠ与MluⅠ，替换后PRRSV XZ06a感染性克隆对应区段。引物对XZ11520-F/XZ12753-R扩增产物大小、PacⅠ/MluⅠ酶切产物大小均与预期大小一致，电泳结果见图4；NheⅠ/EcoRⅤ双酶切产物为15 832 bp和4500 bp，电泳结果见图5，成功构建了携带酶切位点的感染性克隆pCA-XZ06a∧。

2.4 携带EGFP基因感染性克隆构建 PCR方法克隆EGFP基因，大小为726 bp，PacⅠ/MluⅠ分别双酶切EGFP基因与pCA-XZ06a∧，经连接、抗性筛选、测序鉴定获得携带EGFP基因的病毒感染性克隆pCAXZ06a∧EGFP。

2.5 重组病毒的拯救 感染性克隆pCA-XZ06a、pCA-XZ06a∧转染后4～5 d即出现PRRSV特征性病变，而pCA-XZ06a∧EGFP出现特征性病变时间有所延迟，一般5～7 d出现病变，出现的病变与GFP表达如图6所示。获得的拯救病毒依次命名为rCA-XZ06a、rCA-XZ06a∧和rCA-XZ06a∧EGFP。

图2 引物XZ11983TRS-F/XZ12101-R PCR产物电泳图Fig.2 The electrophoresi figure of PCR products amplified with primers XZ11983TRS-F and XZ12101-R

图3 引物XZ7594-F/XZ11982-R PCR产物电泳图Fig.3 The electrophoresi figure of PCR products amplified with primers XZ7594-F and XZ11982-R

2.6 表达EGFP重组PRRSV噬斑纯化 对重组病毒rCA-XZ06a∧EGFP进行噬斑纯化，结果见图6。挑取能够表达EGFP的噬斑扩大培养，传至25代，重组病毒病变灶与EGFP发光团完全匹配，最终获得能够稳定传代表达EGFP的重组病毒。

2.7 重组病毒EGFP表达检测 重组病毒rCA-XZ06a∧EGFP感染Marc-145细胞后第5、8、16、24、48 h时进行EGFP表达检测，结果见图7。表明EGFP表达产物在重组蛋白感染Marc-145后第16 h能最初检测到，随着感染时间增加，蛋白表达量升高；病毒M蛋白检测结果与EGFP一致。

图4 引物XZ11520-F/XZ12753-R PCR与酶切产物电泳图Fig.4 The electrophoresi figure of PCR and digestion products amplified with primers XZ11520-F and XZ12753-R

图5 重组质粒pCAGEN- XZ06a∧酶切产物电泳图Fig.5 The electrophoresi figure of digest products of the plasmid pCA-XZ061201a∧

2.8 重组病毒生长曲线 以0.1 MOI感染Marc-145细胞，收获感染12、24、36、48、60、72与84 h重组病毒，测定其TCID50，生长曲线如图8所示，拯救获得的rCA-XZ06a、rCA-XZ06a∧EGFP与亲本PRRSV相比，病毒增殖趋势基本一致，但pCA-XZ06a∧EGFP病毒滴度略微降低。

3 讨论

图6 重组病毒rCA-XZ06a∧EGFP拯救与EGFP表达（200×）Fig.6 Rescue of rCA-XZ06a∧EGFP and expression of EGFP (200×)

图7 rCA-XZ06a∧EGFP感染EGFP表达动态检测Fig.7 Detection of EGFP at the time points infected with rCA-XZ06a∧EGFP expressing the EGFP

图8 病毒生长曲线Fig.8 Growth kinetics of the parental virus, recombinant virus and recombinant virus expressing EGFP

利用反向遗传操作技术，建立PRRSV感染性克隆并表达外源基因已开展了大量研究，插入位点主要包括病毒Nsp2基因内部、ORF1b与ORF2之间、ORF7与3'UTR之间，Fang[19]、Wang[20]、Han[21]等均将EGFP基因与Nsp2基因融合表达，获得了能够表达EGFP的重组病毒，但Fang等[19]将基于北美1型PRRSV的重组病毒在Marc-145细胞传至第7代时，有15%比例重组病毒无法观察到EGFP，对其诱因的研究表明，病毒在传代过程无法观察到EGFP是因为在该蛋白N末端1～159氨基酸序列缺失的同时，在160氨基酸残基前额外插入了2个氨基酸残基；同样，Han等[21]也发现随着病毒传代，荧光逐渐消失；Pei等[14]将EGFP基因插入ORF1b与ORF2a之间，传37代后重组病毒保持表型稳定。本研究构建了携带ORF6 TRS序列重组PRRSV毒株，将EGFP基因插入至ORF1b与ORF2之间，在传代过程中发现有的病变灶无法观察到荧光，因此进行了连续噬斑克隆纯化，传至25代病毒保持了遗传稳定性，EGFP能够稳定表达。因此，作者认为影响外源基因插入后稳定传代表达的因素较为复杂，包括插入位点、目的基因大小、表达产物对病毒复制的影响等，病毒为了保持自身的遗传特性，通过未知机制破坏外源基因的完整性或者干扰其转录翻译。

将PRRSV作为病毒载体构建重组病毒，表达猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）、猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）等免疫保护性蛋白基因或者中和抗原表位[22-28]，以及表达IL-4、GM-CSF、IFN等细胞因子[15-17]，除了表达IFN基因能够明显抑制病毒的复制，其他重组病毒均获得良好的增殖效率。最新研究成果表明[23]，以PRRSV致弱毒株DS722同时重组表达猪圆环病毒2型与猪流感病毒，构建了“三价”疫苗并免疫猪，用PRRSV攻击，肺损伤和病毒RNA载量显著减少，用PCV2攻击，淋巴器官病变和病毒DNA载量部分减少，当用SIV攻击时，免疫猪急性呼吸症状显著降低，该研究结果表明PRRSV可作为潜在的活病毒疫苗载体开展探索研究。本研究应用病毒载体系传代致弱毒株，源于具有高致病性PRRSV显著特点的毒株，即Nsp2基因缺失90个核苷酸（2779～2781 nt、2933～3019 nt分别连续缺失3个、87个核苷酸[18,29-31]），构建感染性克隆，并将EGFP基因插入ORF1b与ORF2之间，能够高效表达EGFP，为进一步开发疫苗制剂奠定基础。

总之，本研究构建了能够稳定表达EGFP的重组PRRSV毒株，为开展PRRSV病毒复制机制、感染特性、致病机制、疫苗开发等研究奠定了坚实的基础。