周晓帆 李静 王瑞

摘要：以安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）为材料提取基因组，对matK基因序列进行扩增，扩增产物经凝胶电泳分析后送生物技术公司测序，并对测序结果进行分析。结果表明，安康市花魔芋matK基因全长1 551 bp，预测编码516个氨基酸;系统进化树结果显示，花魔芋与Amorphophallus  maxwellii、田阳魔芋（Amorphophallus  corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus  krausei）的亲缘关系最近。

关键词：花魔芋（Amorphophallus konjac）;matK基因;序列分析;安康市

Abstract： The genome of the Amorphophallus konjac from Ankang city was extracted and the matK gene sequence was amplified. After confirmed by gel electrophoresis， amplified product was sequenced and analyzed. Results showed that the matK gene of Amorphophallus konjac from Ankang city was 1 551 bp in length and predicted to encode 516 amino acids. The phylogenetic tree showed that the Amorphophallus konjac had the closest relationship with Amorphophallus maxwellii， Amorphophallus corrugatus and Amorphophallus krausei.

Key words： Amorphophallus konjac; matK gene; sequence analysis; Ankang city

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）为多年生天南星科草本植物，是世界上惟一能够大量提供葡甘露聚糖的重要经济作物。目前已命名的魔芋种属达200多个，中国已记载的魔芋属种约20种[1]，广泛分布在秦岭大巴山、四川盆地、云贵高原、滇南和台湾等地区[2]。当前的魔芋种植是在传统的栽培基础上发展起来的，地方品种之间的特性差异较大[3]，种质资源性状差异明显，遗传多样性丰富[4]，为魔芋的分类及种质资源鉴定带来了一定困难。

近年来，分子标记技术已成为检测植物种质资源多样性和鉴定种质亲缘关系的重要工具，显示出较好的应用前景[5]。matK序列位于叶绿体基因组trnK基因的内含子中，是叶绿体基因组蛋白编码基因中进化速率最快的基因之一，被广泛应用于植物种质资源的鉴定和亲缘关系的研究[6-8]。位于秦巴腹地的陕西省安康市有着悠久的魔芋种植历史[9]。本研究从安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）中克隆得到matK基因的全长序列，并对其进行简单的生物信息学分析，为魔芋的种质资源鉴定和亲缘关系研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用花魔芋由安康学院保存，取新鲜叶片用去离子水冲洗干净，吸水纸吸干后于-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 叶绿体DNA的提取  参照Fulton等[10]的方法提取花魔芋的基因组，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存。

1.2.2 常规PCR扩增反应 根据NCBI公布的芋属叶绿体基因组序列（GenBank 登录号KY769273.1），用软件Primer Premier 5.0设计matK的引物，正向：5′-TGGAAAGATAGGAAGAAGA -3′，反向：5′-CTTAGATTAGATCCCGAAA-3′。 PCR扩增体系：ddH2O 35 μL，10×缓冲液（buffer）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L正向引物2 μL，10 μmol/L反向引物2 μL，5 U/μL Taq酶1 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，变性、退火、延伸3个阶段34个循环;72 ℃终延伸5 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 测序及分析 PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列用BioEdit软件进行处理，在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網站进行Blast 比对，用MEGA 7.0构建分子系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及测序结果分析

对PCR扩增产物进行凝胶分析显示，扩增片段长度约1 800 bp（图1），与预期相符。对测序结果分析得知该基因全长1 551 bp，预测编码516个氨基酸（图2）。将该核苷酸序列在NCBI进行Blastn，发现该序列与花魔芋matK基因序列（AF387398.1）有2个碱基的差异，序列相似性达99%。

2.2 matK基因的系统进化分析

以桑树（Morus alba）为外类群，用Neighbor-joining法构建魔芋属matK基因的系统进化树。结果（图3）显示，安康市花魔芋与Amorphophallus maxwellii、田阳魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）的亲缘关系最近。

3 讨论

叶绿体基因与核基因组和线粒体基因组相比较为保守，matK序列的进化速率快[11]，一般用于科内和种间关系的研究。在植物界中，很难找到一个合适的DNA条形码来区分所有的物种，在分子水平鉴别物种时可以采用序列组合的方式，一方面鉴别的准确性高，另一方面可以分析物种亲缘关系的远近。各国的研究学者们在植物DNA条形码的研究中提出过多种序列组合分析的方案[12]，中国学者认为三序列组合matK+trnK-psbA+rbcL和两序列组合matK+rbcL、matK+trnK-psbA、trnK-psbA+rbcL对芋族有较好的鉴定率，但是采用三序列组合识别准确率低于两序列组合[13]。

本研究克隆并分析了安康市花魔芋的matK序列，Neighbor-joining法构建的系统进化树表明安康市花魔芋与Amorphophallus maxwellii、田阳魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）有较近的亲缘关系。鉴于单独的matK序列对亲缘关系鉴定存在一定的局限性，因此今后的研究中可以考虑采用多种序列组合的方式进行。

参考文献：

[1] 刘二喜. 魔芋种质资源分类鉴定技术、引种适应性评价及繁殖特性研究[D]. 湖北恩施：湖北民族学院，2016.

[2] 刘佩瑛. 魔芋学[M]. 北京：中国农业出版社，2004.

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[11] 馮婷婷. 芥菜型油菜叶绿体基因组DNA多态性研究[D]. 武汉：华中农业大学，2017.

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[13] 刘宇婧. DNA条形码在天南星科芋族植物研究中的应用[D]. 北京：中央民族大学， 2011.