高秀娥，梁雪晴，刘薇，钟雪松，付慧鑫，曹柏营

（吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052）

黑豆富含蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和矿物质[1-3]，种皮中花青素含量非常丰富[4]，这种类黄酮化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、预防动脉粥样硬化等多种生物活性[5-8]，是活性较高的植物源抗氧化剂。

在植物源花青素提取中，蛋白质、糖类、单宁等杂质的存在影响花青素产品的纯度、稳定性和生物活性[9-11]，采用柱层析、高速逆流色谱和高效液相色谱等方法可去除杂质，精制花青素[12-14]，从工业化应用角度考虑，大孔树脂柱层析法最易应用，报道的树脂型号有 AB-8、D101、XAD-7、DM301 和 DM21 等[15-17]，树脂孔径、表面积和极性等对花青素精制效果影响显著。

植物花青素表现出较好的降血糖活性，可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，阻碍葡萄糖的形成，降低小鼠餐后血糖水平[18-20]。目前关于黑豆花青素降血糖活性的报道较少，本文以黑豆皮为原料，利用大孔树脂柱层析法对黑豆花青素进行精制，并探讨其对α-葡萄糖苷酶和α-胰淀粉酶活性的影响，从体外评价黑豆花青素的降血糖活性，为黑豆资源的精深加工提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

黑豆选择乌皮青仁豆：购于农贸批发市场，破碎后风选收集黑豆皮，粉碎，过60目标准筛，备用。

1.1.2 试剂与仪器

722SP型可见分光光度计：上海圣科仪器设备有限公司；THZ-100B型恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；YDF50型多功能粉碎机：浙江屹立工贸设备有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；ZD-2型电位滴定仪：上海汇分电子科技有限公司；RE-3000B型循环水真空泵：上海亚荣仪器责任有限公司。

α-葡萄糖苷酶（100U/mL）、α-胰淀粉酶（50U/mg）：上海金穗生物科技有限公司；4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、3，5-二硝基水杨酸、阿卡波糖：美国Sigma公司；D101、AB-8型大孔吸附树脂：天津允开树脂科技有限公司；XR929H、XR6702、XR901H、XR828S型大孔吸附树脂：上海逊尔化工科技有限公司；无水乙醇、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、无水醋酸钠（均为分析纯）：沈阳化学试剂厂。

1.2 黑豆花青素的提取工艺

以60%乙醇作为提取溶剂，按1∶15（g/mL）料液比，在60℃的条件下提取黑豆花青素3 h，回流提取2次，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥备用，黑豆花青素纯度为28.14%。

1.3 黑豆花青素的精制

1.3.1 吸附率与解吸率的计算

黑豆花青素含量的计算方法参考曹柏营等[21]方法，吸附率和解吸率计算公式如下：

式中：C0为原液中黑豆花青素的含量，mg/mL；C1为吸附后溶液中黑豆花青素含量，mg/mL；C2为洗脱后溶液中黑豆花青素含量，mg/mL。

1.3.2 树脂优选

取预处理后的D101、AB-8、XR929H、XR6702、XR901H和XR828S型大孔吸附树脂各10 g，置于三角瓶中，分别加入20 mL 0.5 mg/mL的黑豆花青素原液，室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测定黑豆花青素含量，计算吸附率；吸附黑豆花青素的树脂置于三角瓶中，分别加入20 mL 60%的乙醇水溶液，室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测黑豆花青素的含量，计算解吸率，选择吸附率和解吸率最好的树脂做为黑豆花青素精制树脂。

1.3.3 树脂吸附和解吸平衡曲线

称取10 g XR6702型大孔树脂，置于三角瓶中，添加100 mL黑豆花青素溶液，室温（25℃）振荡，每隔30 min测定一次黑豆花青素含量，并绘制出吸附率-时间曲线；吸附结束后，过滤去除滤液，加入100 mL 60%的乙醇水溶液，室温（25℃）振荡，每隔30 min测定一次黑豆花青素含量，并绘制出解吸率-时间曲线。

1.3.4 黑豆花青素浓度对吸附率的影响

取质量浓度 0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0、5、10 mg/mL的黑豆花青素溶液各20 mL，置于三角瓶中，加入10 g预处理的XR6702型大孔树脂，室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测黑豆花青素含量，计算吸附率。

1.3.5 吸附液pH值对黑豆花青素吸附率的影响

取20 mL质量浓度2.0 mg/mL的黑豆花青素置于不同三角瓶中，pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入10 g预处理的XR6702型大孔树脂，室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测黑豆花青素含量，计算吸附率。

1.3.6 乙醇浓度对黑豆花青素解吸率的影响

三角瓶中加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各50 mL，分别加入10 gXR6702型大孔树脂（吸附饱和），室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测黑豆花青素含量，计算解吸率。

1.3.7 解吸液pH值对黑豆花青素解吸率的影响

三角瓶中各加入60%的乙醇50 mL，pH值调整为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分别加入 10g XR6702型大孔树脂（吸附饱和），室温（25℃）振荡3 h，过滤得滤液，测黑豆花青素含量，计算解吸率。

1.3.8 洗脱流速对解吸率的影响

XR6702型大孔树脂经预处理后置于层析柱中（3.5 cm×50 cm），以去离子水平衡12 h，加入2.0 mg/mL的黑豆花青素溶液15 mL，全部进入树脂层后，洗脱剂为 60%乙醇水溶液，分别以 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL/min的解吸流速洗脱，收集解吸液，测黑豆花青素含量，计算解吸率。

1.4 黑豆花青素的体外降血糖活性

1.4.1 黑豆花青素对α-葡萄糖糖苷酶活性的影响

按王锐[22]的测定方法，并做适当修改。各取2.0 mL质量浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL的精制黑豆花青素溶液，加入α-葡萄糖糖苷酶（45 U/mL）和 PNPG（15 mmol/L）各 0.5 mL，涡旋1 min，置于37℃孵育30 min，取出后立即加入NaCO3（1 mol/L）1 mL终止反应，于405 nm处测定吸光度，以2.0 mL蒸馏水代替黑豆花青素作为阴性对照组，以阿卡波糖为阳性对照组。各组重复测定3次，酶活性抑制率计算公式如下：

式中：AS为样品吸光度值；ASO为加入灭活酶的样品吸光度值；AC为空白组吸光度值；ACO为加入灭活酶的空白组吸光度值。

1.4.2 黑豆花青素对α-胰淀粉酶活性的影响

按曾桥等[23]的方法测定，并做适当修改。分别配制 质量分数为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL的精制黑豆花青素溶液，取不同浓度黑豆花青素溶液各 0.2 mL，加入 0.2 mL α-胰淀粉酶（1 U/mL），37℃孵育10 min，与0.4 mL可溶性淀粉溶液（2.5 g/L）混合，37℃ 孵育10 min，取出后立即加入3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）显色剂[含1%2，5-二硝基水杨酸和12%酒石酸钾钠的NaOH（0.4 mol/L）溶液]1 mL终止反应，沸水浴10 min，冷却至室温（25℃），加入10 mL去离子水，于540 nm处测定吸光度，以阿卡波糖为阳性对照组。各组重复测定3次，酶活性抑制率按式3计算。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 黑豆花青素的精制工艺优化

2.1.1 大孔吸附树脂优选

不同大孔吸附树脂对黑豆花青素的吸附率和解吸率见图1。

由图1可见，对黑豆花青素吸附率和解吸率最高的是XR6702型树脂，分别达到91.93%和85.74%，显著高于其他5种大孔吸附树脂，XR6702型树脂的极性、颗粒孔径及尺寸适合，对黑豆花青素的吸附能力和解吸能力强于AB-8和D101[24-25]。因此本论文选用XR6702型树脂精制黑豆花青素。

图1 大孔树脂型号对黑豆花青素吸附率和解吸率的影响Fig.1 The adsorption and desorption of microporous adsorbent resins on black soybean anthocyanins

2.1.2 树脂吸附和解吸平衡曲线

XR6702树脂吸附和解吸平衡曲线如图2所示。

图2 吸附和解吸平衡曲线Fig.2 The equilibrium curve of static adsorption and desorption

由图2可见，黑豆花青素的吸附率和解吸率先增加后平缓，180 min后，吸附率变化平缓，趋于饱和，吸附率最高为91.94%；150 min后，解吸率几乎不变，黑豆花青素完全解离，解吸完成，解吸率最高为85.77%。

2.1.3 黑豆花青素浓度对吸附率的影响

黑豆花青素浓度对吸附率的影响见图3。

由图3可见，吸附率随黑豆花青素浓度的增加，先增加后减少，吸附率最大值为90.83%，此时黑豆花青素浓度为2.0 mg/mL，浓度过高，容易引起树脂孔隙堵塞，超出吸附负荷，导致吸附率下降。

2.1.4 吸附液pH值对黑豆花青素吸附率的影响

吸附液pH值对黑豆花青素吸附率的影响见图4。

图3 黑豆花青素浓度对吸附率的影响Fig.3 The effect of various concentrations of black soybean anthocyanins on adsorption rate

图4 吸附液pH值对黑豆花青素吸附率的影响Fig.4 The effect of sample pH on adsorption rate of black soybean anthocyanins

由图4可见，吸附率最高为90.84%，此时的pH值为3.0，随pH值继续增大，黑豆花青素的吸附率呈现下降趋势，酸性条件下黑豆花青素趋于稳定，吸附率较高[26]，因此后续柱层析吸附液的pH值调整为3.0上柱。

2.1.5 乙醇浓度对黑豆花青素解吸率的影响

乙醇浓度对黑豆花青素解吸率的影响见图5。

图5 乙醇浓度对黑豆花青素解吸率的影响Fig.5 The effect of ethanol concentration on desorption rate of black soybean anthocyanins

由图5可见，解吸率最高为85.34%，此时乙醇浓度为60%，黑豆花青素含量最高，解吸率此后出现下降趋势。洗脱液选定为60%浓度的乙醇。

2.1.6 解吸液pH值对黑豆花青素解吸率的影响

解吸液pH值对黑豆花青素解吸率的影响见图6。

图6 洗脱液pH值对黑豆花青素解吸率的影响Fig.6 The effect of mobile phase pH on desorption rate of black soybean anthocyanins

由图6可见，黑豆花青素的解吸率出现最大值，达到85.15%，此时pH值为4.0，此后pH值继续增大，解吸率呈现下降的趋势。调整解吸液的pH值为4.0。

2.1.7 洗脱流速对黑豆花青素解吸率的影响

洗脱流速对黑豆花青素解吸率的影响见图7。

图7 解吸流速对黑豆花青素解吸率的影响Fig.7 The effect of flow velocity on desorption rate of black soybean anthocyanins

由图7可见，洗脱流速在0.5 mL/min～3.0 mL/min之间，解吸率先增大后减小，解吸率最大值为87.19%，洗脱流速为1.5 mL/min。因此，1.5 mL/min为最佳洗脱流速。

2.1.8 黑豆花青素精制工艺参数

黑豆花青素精制选用XR6702型大孔树脂，装填于Φ3.5 cm×50 cm层析柱中，吸附条件：原液浓度2 mg/mL，pH 3.0，体积 15 mL，解吸条件：60%乙醇水溶液（pH 4.0），流速1.5 mL/min。黑豆花青素的洗脱曲线如图8所示。

图8 黑豆花青素洗脱曲线Fig.8 The elution curve of black soybean anthocyanins

如图8所示，精制后得到单一黑豆花青素洗脱峰，收集试管（编号25～33）内的液体，减压蒸馏，冷冻干燥，测其黑豆花青素纯度为84.92%。

2.2 黑豆花青素的体外降血糖活性

2.2.1 黑豆花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响

黑豆花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响如图9所示。

图9 黑豆花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.9 Inhibition activity of black soybean anthocyanins on α-glucosidase

由图9可见，在质量浓度0.5 mg/mL～5.0 mg/mL范围内，黑豆花青素对α-葡萄糖苷酶的活性表现出一定抑制作用，具有较好的剂量效应关系，抑制率最高为 91.36%（5.0 mg/mL），IC50值为 1.65 mg/mL；阿卡波糖的最高抑制率为74.31%，IC50值为1.22 mg/mL。虽然黑豆花青素的IC50值高于阿卡波糖，但相同浓度时表现出的α-葡萄糖苷酶抑制率高于阿卡波糖，高出22.94%。

2.2.2 黑豆花青素对α-胰淀粉酶活性的影响

黑豆花青素对α-胰淀粉酶活性的影响见图10。

图10 黑豆花青素对α-胰淀粉酶活性的影响Fig.10 Inhibition activity of black soybean anthocyanins on αamylase

由图10可见，在质量浓度0.5 mg/mL～5.0 mg/mL范围内，黑豆花青素对α-胰淀粉酶的活性表现出一定抑制作用，且具有较好的剂量效应关系，抑制率最高为 89.17%（5.0 mg/mL），IC50值为 3.35 mg/mL；阿卡波糖最高抑制率为71.93%，IC50值为3.67mg/mL。黑豆花青素对α-胰淀粉酶的抑制率高于阿卡波糖，高出23.97%。

3 结论

本文利用大孔树脂精制黑豆花青素并评价其降血糖活性。XR6702型大孔吸附树脂是精制黑豆花青素的最佳树脂，吸附条件：原液浓度2 mg/mL，pH 3.0，体积15 mL，解吸条件：60%乙醇水溶液（pH 4.0），流速1.5 mL/min，精制后黑豆花青素纯度为84.92%；精制后的黑豆花青素对α-葡萄糖苷酶和α-胰淀粉酶的活性都表现出一定的抑制作用，且表现出良好的剂量效应关系，比阿卡波糖组分别提高了22.94%和23.97%，黑豆花青素在体外表现出较好的降血糖活性，关于黑豆花青素的体内降血糖活性及作用机制将在后续课题研究中进行。