慈一帆 王海桃,2 刘晓涵 陈沉 李倩倩 宋扬

(1 青岛大学公共卫生学院，山东 青岛 266071； 2 青岛大学第二附属医院)

结直肠癌(CRC)是世界上发病率排第三位的肿瘤[1]。据目前估计，全世界每年大约新增100多万例CRC患者[2]。CRC的发生发展是一个复杂的、长期的过程[3]，在肿瘤微环境中，各种促炎递质通过复杂的信号传导途径促进肿瘤的进展[4]。基质金属蛋白酶(MMP)由肿瘤细胞和基质细胞合成，在CRC的发生发展中起重要作用[5]。其中MMP-2和MMP-9与细胞分化、凋亡、血管生成、免疫反应和癌细胞生长有关[6]。卡培他滨是临床上治疗CRC的常用药物，通过干扰细胞DNA合成，发挥抗肿瘤作用，但应用卡培他滨的部分患者容易发生腹泻等副作用[7-9]。植酸(IP6)是一种天然抗氧化剂，存在于全谷类、坚果类及豆类中[10]，具有抗肿瘤作用[11]。肌醇(INS)是一种饱和的环状多元醇，能协同IP6抑制CRC的发生和发展[12]。IP6与INS在正常饮食中大量存在，能安全有效地从胃肠道吸收[13]，IP6与INS合用可以辅助治疗乳腺癌、CRC，缓解传统化学疗法的副作用，提高患者生活质量[14-17]。IP6+INS是否可以辅助卡培他滨抑制CRC生长，目前尚未见相关文献报道。本研究通过盲肠壁下注射肿瘤细胞方法建立小鼠CRC原位移植模型，研究IP6+INS辅助卡培他滨对CRC干预作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养

SPF级BALB/c雄性小鼠100只，6～7周龄，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司。在SPF级(无特定病原体)条件下，适应性喂养1周，平均湿度(52±8)%，平均温度(24±2)℃，AIN93M标准饲料喂养，自由饮水。该研究通过了青岛大学附属医院医学伦理委员会的审批(伦理编号：QYFYWZLL25667)。

1.2 细胞株及细胞培养

鼠CRC细胞CT-26购自中国科学院上海细胞库。细胞培养于含体积分数0.15的胎牛血清以及10 g/L青链霉素(100 kU/L青霉素,0.1 g/L链霉素)的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中常规培养。

1.3 试剂

IP6以及卡培他滨(上海麦克林生化科技有限公司)，INS(上海源叶生物科技有限公司)，ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)，D-荧光素虫钾盐(北京索莱宝科技有限公司)，TRNzol总RNA提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser以及SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)ROX plus(宝生物工程(大连)有限公司)，Western blot相关试剂(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.4 小鼠CRC原位移植模型的制备

体外培养CRC细胞CT-26，首先用慢病毒转染CT-26细胞，后用嘌呤霉素筛选出能稳定表达荧光蛋白的CT-26细胞，常规培养至对数期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化重悬细胞，制备成1×109个细胞/L密度的细胞悬液备用。100只小鼠适应性喂养1周以后，腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠(80 mg/kg)麻醉，在小鼠左下腹做一长1.5 cm左右的纵切口，用1 mL注射器采集0.2 mL细胞悬液，注射到小鼠盲肠浆膜层下，注射完毕后小心退出注射器，确认无出血后逐层关腹缝合。

1.5 小鼠肿瘤生长情况观察

根据前期预实验结果，在造模后第3周对小鼠进行活体成像检测，观察小鼠肿瘤生长情况。

1.6 实验动物分组及干预

活体成像结果显示，在造模后第3周，有69只造模小鼠出现肿瘤。剔除体质量较轻和生长状态差的成瘤小鼠，最终将48只成瘤小鼠纳入实验研究。按IP6+INS(干预和不干预)和卡培他滨(干预和不干预)两个因素及两个因素的不同水平交叉组合分为4组，分别为模型组(A组)、卡培他滨组(B组)、IP6+INS组(C组)、卡培他滨+IP6+INS组(D组)，4组小鼠分别用生理盐水0.2 mL、60 mg/kg卡培他滨0.2 mL、80 mg/kg IP6和80 mg/kg INS共0.2 mL、60 mg/kg卡培他滨和80 mg/kg IP6及80 mg/kg INS共0.2 mL灌胃，每周灌胃5 d，连续灌胃6周。记录小鼠进食饮水量(每2 d记录一次，计算各组小鼠日平均进食饮水量)，观察小鼠一般生长状态。各组小鼠日平均进食饮水量=记录的各组小鼠进食饮水总量/(该组小鼠总数×2)。

1.7 动物处理及原位瘤组织称质量

根据小鼠的生存状态确定处死时间。于末次灌胃12 h(禁食禁水)后摘除眼球取血并处死小鼠，血液离心后取上清液于-80℃冰箱保存。取原位瘤组织称质量。

1.8 小鼠血清中趋化因子CCL20、白细胞介素10(IL-10)、IL-12表达水平的检测

按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书操作，于酶标仪中读取波长450 nm处各孔吸光度，按稀释标准品制作的标准曲线计算血清中CCL20、IL-10、IL-12水平。

1.9 小鼠原位瘤组织中MMP-2、MMP-9 mRNA表达的检测

取50 mg原位瘤组织，在预冷的研钵中将组织样本研磨成粉末状后加入Trizol，提取总RNA。使用NanoDrop®ND-2000测定RNA浓度和纯度，然后使用逆转录试剂盒对2 μg总RNA进行反转录，在20 μL反应体系中进行PCR。PCR采用两步法，条件如下，95 ℃预变性5 min；然后95 ℃变性30 s, 60 ℃退火/延伸34 s,共进行50个循环。检测原位瘤组织中目的mRNA的CT值，计算得到各组目的mRNA的相对表达水平(计算公式2-△△CT)。实验重复3次，结果取均值。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列和产物长度

1.10 小鼠原位瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达的检测

取约50 mg原位瘤组织，加入含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，提取肿瘤组织的总蛋白。采用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。测定完成后向各组蛋白中加入上样缓冲液，混匀加热，使蛋白变性。蛋白冷却后加入到SDS-PAGE凝胶上电泳分离，将分离后的蛋白分子转移至PVDF膜上。用含脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后重新加入二抗孵育2 h。在显影仪中显影，得到目的蛋白条带。以目的蛋白与内参灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

1.11 统计分析

2 结 果

2.1 各组小鼠平均进食饮水量的变化

析因设计方差分析结果显示，IP6+INS与卡培他滨无交互作用(P>0.05)，IP6+INS干预可以升高肿瘤小鼠的日均进食饮水量(F=10.627、18.053，P<0.05)，卡培他滨干预对肿瘤小鼠日平均进食饮水量无明显影响(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠日均进食量、饮水量比较

2.2 活体成像结果

活体成像结果显示，造模3周后，小鼠原位组织区域出现显影(图1)，有肿瘤生长。

图1 小鼠CRC原位移植模型建立3周时活体成像结果

2.3 各组小鼠生存情况及原位瘤质量比较

实验期间A、B组各有4只和2只小鼠死亡，为恶病质或原位肿瘤致肠梗阻所致。实验结束时A、B、C、D组小鼠的原位瘤质量分别为(5.90±0.41)、(2.55±0.41)、(3.53±0.96)、(1.71±0.58)g,经析因设计方差分析结果显示，IP6+INS与卡培他滨对原位瘤质量有交互作用(F=13.772，P<0.05)，当有或无卡培他滨干预时，IP6+INS对原位瘤质量均具有明显影响(F=8.868、62.123,P<0.05)，当有或无IP6+INS干预时，卡培他滨对原位瘤质量均有明显影响(F=45.698、114.796,P<0.05)。

2.4 各组小鼠血清中CCL20、IL-10、IL-12表达水平比较

析因设计方差分析结果显示，IP6+INS与卡培他滨有交互作用(F=5.731～50.311，P<0.05)；有或无卡培他滨干预时，IP6+INS对小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表达水平均具有明显的影响(F=30.753～321.372，P<0.05)；有或无IP6+INS干预时，卡培他滨对小鼠血清中CCL20、IL-10以及IL-12表达水平均具有明显的影响(F=20.578～757.673，P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表达水平比较

2.5 各组小鼠原位瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达情况比较

析因设计方差分析结果显示，IP6+INS与卡培他滨有交互作用(F=7.007～9.974，P<0.05)；当有或无卡培他滨干预时，IP6+INS对小鼠肿瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白以及mRNA表达水平均有明显的影响(F=7.330～82.807，P<0.05)；当有或者无IP6+INS干预时，卡培他滨对小鼠肿瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达水平均有明显的影响(F=10.687～80.808，P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠肿瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达水平比较

3 讨 论

本研究采用盲肠壁下注射肿瘤细胞的方法建立小鼠CRC原位移植模型，模型中小鼠的肿瘤发生率为69%，通过卡培他滨、IP6+INS、卡培他滨+IP6+INS 3种方式对肿瘤模型小鼠进行干预，结果表明3种干预方式均可以显著降低小鼠的原位瘤质量，其中卡培他滨+IP6+INS降低CRC原位瘤质量的效果最为显著，说明IP6+INS不仅可以抑制肿瘤的进展，而且可以协同卡培他滨更好地发挥抗肿瘤的作用。

CRC的发生发展与机体免疫系统的调节密切相关[18]，炎症细胞因子在免疫细胞的分化、成熟、增殖、激活、免疫调节和介导炎症反应中起着关键作用，参与多种生理和病理反应[19]。在肿瘤发生发展过程中，IL-10作为一种重要的免疫抑制因子，可以通过多种途径抑制免疫系统对肿瘤的杀伤作用，促进肿瘤的发展[20]。IL-12是一种由树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴母细胞在抗原刺激下自然产生的细胞因子，在自身免疫性疾病中发挥重要作用[21]。肿瘤细胞分泌的CCL20不仅可以影响免疫细胞的功能，还可以直接作用于肿瘤细胞，目前已有研究表明CCL20通过刺激CCR6/NF-kB信号和PI3K/AKT-ERK信号调节肿瘤细胞的增殖、肿瘤侵袭和转移[22-23]。本研究结果显示，卡培他滨、IP6+INS、卡培他滨+IP6+INS 3种干预措施均可以显著降低CRC小鼠血清中IL-10、CCL20表达水平，升高IL-12表达水平，以卡培他滨+IP6+INS效果最为显著。

研究显示MMP可以影响免疫反应，并能促进血管生成影响肿瘤进展[5-6]。KATRIN等[6]研究发现，MMP-2和MMP-9蛋白在恶性结肠黏膜中的表达增加。本研究发现，卡培他滨、IP6+INS、卡培他滨+IP6+INS 3种干预措施均可以降低CRC小鼠原位瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表达，以卡培他滨+IP6+INS的作用效果最佳。

CRC的发生发展是一个复杂的过程，其中炎症因子以及MMP在CRC发展过程中发挥着重要的作用[6，19]。本研究结果显示，卡培他滨、IP6+INS、卡培他滨+IP6+INS均可以影响炎症因子以及MMP的表达，具体表现为降低CRC小鼠血清中IL-10和CCL20的表达水平，升高IL-12的表达水平；降低CRC小鼠原位瘤组织中MMP-2、MMP-9 mRNA以及蛋白的表达水平，其中以卡培他滨+IP6+INS作用效果最佳。

综上所述，IP6+INS可以辅助卡培他滨抑制BALB/c小鼠CRC的生长，其作用机制可能与影响炎症因子及降低MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达有关，但其具体作用机制还需要进一步深入研究。