文 畅，李 梁，舒鹏程，强伯勤，彭小忠,2*

(1. 中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室 医学灵长类研究中心 神经科学中心, 北京 100005;2. 中国医学科学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118)

三胸家族(trithorax group proteins, TrxG)与多梳家族(polycomb group proteins, PcG)是一对进化上高度保守，功能上相互拮抗的组蛋白修饰复合物，二者分别通过促进组蛋白H3K4或H3K27的甲基化修饰，改变染色质结构，进而分别激活或抑制基因的转录[1]。 TrxG复合物由WDR5、ASH2L、RBBP5和DPY30 4种核心成员、SET1A、SET1B、MLL1、MLL2、MLL3和MLL4中任意1种甲基转移酶分子及一些辅助成员组成，TrxG各复合物通过促进组蛋白H3K4me3修饰形成，使染色质结构松散，便于转录因子的结合，进而激活基因转录[2]。

DPY30通过与ASH2L发生直接相互作用，从而参与TrxG复合物形成，这种相互作用对TrxG的甲基转移酶活性有重要的调节作用[3-5]。在小鼠神经系统发育过程中条件性敲除DPY30与ASH2L会引起相似的表型[6-7]，并且DPY30与ASH2L均对上皮性卵巢癌细胞增殖、运动及上皮间质转化等具有重要作用[8-10]，但二者之间的表达相关性目前尚不明确。本研究通过一系列实验发现在人体各组织及K562细胞分化过程中，ASH2L与DPY30表达具有相关性，且ASH2L可能调控了DPY30蛋白水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:ASH2L条件性敲除(ASH2L-cKO)小鼠通过ASH2Lfl/fl小鼠与D6-Cre工具鼠配种所得的二代杂合子小鼠再次交配获得，采用同窝野生型(Wild Type, WT)小鼠作为对照。ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠可在大脑皮质特异性敲除ASH2L基因[6]。小鼠饲养在无特定病原体环境中，饲养温度20 ℃～24 ℃，自由饮食，昼夜各12 h，所有动物护理和实验均已获得中国医学科学院/北京协和医学院动物保护与利用委员会的批准(文号：ACUC2010A02-123)，所有程序均在符合实验动物法规(中国科学技术技术委员会第2号命令)下进行。

1.1.2 实验细胞系:人慢性髓源白血病(K562)细胞系(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.3 主要试剂:成人多组织(MTNTM)膜和Northern杂交液(Clontech公司)；探针标记试剂盒(Promega公司)；，ASH2L抗体、MLL1抗体和MLL2抗体(Bethyl公司)；DPY30抗体和β-actin抗体(Sigma-Aldrich公司)；WDR5抗体(RDsystem公司)；RBBP5抗体(Abcam公司)； H3K4me3抗体(Millpore公司)；免疫荧光抗体辣根过氧化物酶交联的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶交联的山羊抗小鼠IgG和辣根过氧化物酶交联的兔抗山羊IgG(北京中杉金桥生物技术公司)；ChIP-seq所用ASH2L和H3K4me3抗体(Active Motif公司)；Lipofectamin2000和Opti-MEM(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Vazyme公司)；荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；引物合成(北京擎科生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Nortehrn blot检测分子表达:将MTNTM膜置于6×SSC中浸湿，置于杂交管中，加入68 ℃预热的杂交液5 mL，68 ℃预杂交30 min，弃预杂液；将32P标记的探针(25 ng)98 ℃变性5 min，与预热的杂交液混匀，加到杂交管内，68 ℃杂交60 min；将杂交膜置于2×SSC,0.5% SDS 中室温洗3次，每次10 min，于0.1×SSC,0.1% SDS中，68 ℃洗2次，每次20 min；将湿膜置于保鲜膜内，压X线片，-70 ℃曝光。

1.2.2 诱导K562细胞分化:取对数增殖期的K562细胞，按(4～5)×105个/mL重悬于新配置的培养基中。将1 mg/mL(1.6×10-3mol/L)PMA储藏液稀释100倍，每10ml细胞悬液加稀释后的PMA 31 μL，分别于诱导0.5、1、2、4和8 h后收获细胞，Trizol法提取总RNA。

1.2.3 Western blot检测蛋白水平:用TNTE裂解液提取小鼠大脑皮质蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，配置适当比例的凝胶进行蛋白电泳，内参蛋白β-actin抗体稀释比例为1∶5 000，ASH2L、MLL1、MLL2和H3K4me3抗体稀释比例为1∶1 000，WDR5和RBBP5抗体稀释比例为1∶200，DPY30抗体稀释比例为1∶100，辣根过氧化物酶交联的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶交联的山羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶交联的兔抗山羊IgG稀释比例均为1∶5 000。

1.2.4 RT-qPCR检测RNA水平:Trizol法提取总小鼠大脑皮质总RNA，按照说明书用反转录试剂盒进行RNA反转录反应，配置相应体系进行RT-qPCR反应，RT-qPCR反应条件: 95 ℃预变性3 min，扩增循环50次(循环条件: 95 ℃/10 s，60 ℃/30 s)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃冷却。根据Cq值计算各基因RNA表达水平。qPCR所用引物序列如表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.5 ChIP-seq分析: 本研究中ChIP-seq实验为取小鼠大脑皮质，干冰冻存寄往美国Active Motif公司进行ChIP-seq实验及分析后，采用IGV软件进行结果可视化分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同组织中DPY30与ASH2L表达分布相似

ASH2L在血液系统组织中表达较高，如骨髓、胎肝。DPY30与ASH2L表达分布有一定的相似性，均在骨髓、胎肝中有较高表达，同为TrxG核心成员的WDR5表达则较ASH2L和DPY30低，其与ASH2L的表达相似性较DPY30低(图1)。

2.2 DPY30与ASH2L在PMA诱导K562细胞分化过程中表达趋势相似

以细胞分化初始(0 h)表达量为基准，DPY30与ASH2L表达均随着K562细胞分化逐渐减少，而同为三胸家族核心成员的WDR5的表达则在分化进行的0～1 h短暂地降低后再次升高至接近初始(0 h)水平(图2)。

2.3 条件性敲除ASH2L导致DPY30蛋白减少

ASH2L-cKO小鼠大脑皮质中，组蛋白H3K4me3修饰水平降低，DPY30蛋白减少，而其他成员蛋白含量无明显改变(图3A)，但条件性敲除ASH2L并未导致TrxG核心成员DPY30、WDR5、RBBP5的RNA水平改变(图3B)。

A.expression of ASH2L and DPY30 in various human tissues; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 in various human tissues图1 ASH2L与DPY30在多种人体组织中表达情况Fig 1 Detection of the expression of ASH2L and DPY30 in various human

A.expression of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells’ differentiation; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells differentiation

A.protein expression of TrxG members in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse; B.quantitative analysis of TrxG core components’ mRNA expression in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse compared with WT mouse cortex, *P<0.05(WT:n=3, ASH2L-cKO:n=3)

2.4 H3K4me3与ASH2L在ASH2L与DPY30基因调控区域有分布

H3K4me3与ASH2L在ASH2L与DPY30基因上游调控区域均有分布，但H3K4me3在ASH2L与DPY30基因上游调控区域的结合峰度在WT和ASH2L-cKO小鼠大脑皮质中未出现明显改变(图4，表2)。

表2 ASH2L与DPY30基因位点上ASH2L 与H3K4me3结合峰度分析

3 讨论

TrxG通过促进基因上游调控区域的组蛋白H3K4me3修饰，激活基因转录，在细胞周期调控、机体发育、肿瘤发生等众多生命过程中发挥着十分重要的调控作用[1,2]。ASH2L与DPY30均是TrxG核心成员，ASH2L与甲基转移酶、RBBP5、WDR5和DPY30蛋白分子均能发生相互作用，进而发挥调节酶活性、辅助TrxG募集到染色质相应位置等功能[3-5,11]。DPY30是TrxG中最后被发现的核心成员[12]，在复合体中仅依靠氨基酸残基相互作用，并且这种相互作用对H3K4me3的形成、基因转录调控、细胞增殖分化等过程具有重要作用[3-5]。但DPY30在TrxG复合体中的具体功能目前尚不清楚。

A,B.analysis of the distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 loci图4 ASH2L与DPY30基因位点上H3K4me3与ASH2L在分布情况分析Fig 4 Analysis of distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 gene loci

本研究发现，在不同组织及K562细胞分化过程中，DPY30与ASH2L的表达具有一定的相似性，而TrxG另一核心成员WDR5的表达则不具有这种相似性，ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大脑皮质中DPY30蛋白减少，说明ASH2L可能对DPY30蛋白水平具有调控作用，缺失ASH2L蛋白会导致DPY30蛋白减少，而ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大脑皮质中DPY30的RNA水平改变无统计学意义，说明ASH2L不是在RNA水平，可能是在蛋白水平对DPY30的表达进行调节。同时ChIP-seq结果可视化分析中，H3K4me3与ASH2L在ASH2L与DPY30基因上游调控区域均有分布，但H3K4me3在ASH2L与DPY30基因上游调控区域的结合峰度在WT和ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大脑皮质中未出现明显改变，提示ASH2L与DPY30的转录可能受到TrxG所促进的H3K4me3修饰方式调节，但这种调节并不受ASH2L表达水平的影响，从另一方面说明ASH2L不是在RNA水平对DPY30的表达进行调节。然而，为什么DPY30与ASH2L表达具有相关性，ASH2L是如何调节DPY30蛋白水平的，这些问题目前尚没有解决，需要更多的实验加以探究。