叶 阳，宋新刚，张立恒，任德强

（哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150025）

1 材料与方法

1.1 材料

病毒：PRVR株，哈尔滨元亨生物药业有限公司供应，BHK21细胞增殖后建立种子批，-70℃保存备用。

细胞：PK15细胞北京世纪元亨防疫有限公司提供；ST细胞、BHK21细胞、RK13细胞为本公司自有。鸡胚成纤维细胞取自SPF鸡胚，按原代细胞常规制备方法获得。

胰酶与细胞培养用培养基：购自GIBCO公司，注射用水配制后过滤除菌；新生牛血清品牌为四季青。

仪器设备：T75一次性细胞培养瓶与96孔细胞培养板，康宁公司；CO2培养箱（HF240型），购自HealForce 公司；倒置显微镜，奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖

健康细胞形成致密单层后，弃掉生长液，接种病毒并吸附1h，期间每隔15min晃动细胞瓶1次，保证病毒吸附均匀。加入与生长液等量，含2%新生牛血清的病毒维持液，期间不再换新的培养液。并同时设未接病毒的健康细胞2瓶做对照，置37℃培养箱中静置培养。每日上、下午各观察并记录1次细胞病变情况，75%细胞出现病变时收获，通过冻融释放细胞内病毒，置于-70℃冰柜保存备用。此试验连续重复3次测定病毒含量。

1.2.2 病毒含量测定

消化好的细胞计数后，均匀的加入96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液100μl，细胞形成单层后，将各试验组收获的待测病毒液，用病毒稀释液分别进行10-1～10-8倍梯度系列稀释，每稀释度做6个重复孔，不同稀释度的病毒液加入100μl/孔，健康细胞对照孔加100μl稀释液，培养板四周不用于接种稀释病毒液，避免边缘效应产生。5%CO2培养箱中37℃培养，逐日用倒置显微镜观察到120h，并记录细胞病变出现孔，按Reed- Muench法计算病毒含量。

2 结果与分析

2.1 病变情况

PRVR株按一定比例接种5种细胞，病变达到75%时停止培养。接种ST细胞后20h细胞出现散在灶状细胞圆缩，随后病变细胞逐渐向周边扩展，30h左后收获；PRVR株接种PK15细胞后24h开始出现病变，40h左后收获。PRVR株接种BHK21细胞后30h开始出现病变，38h左后收获。PRVR株接种RK13细胞后13h开始出现病变，20h左后即可收获。PRVR株接种鸡胚成纤维细胞后30h开始出现病变，50h后收获。对照组细胞均未出现细胞病变。

2.2 病毒含量的测定结果（见表1）

表1 PRVR株在不同种细胞上增殖的病毒含量

3 讨论与结论

PRV可在多种动物细胞上增殖，并导致细胞产生病变。本次试验对比了ST、PK15、BHK21、RK13、鸡胚成纤维原代细胞培养PRV，摸索出该病毒在此5种细胞上的增殖规律与病变特点，在原有收毒最佳时机的基础上，通过与生产实际相结合，筛选出最佳的生产用细胞，对疫苗研发和工业化生产起着十分重要的支撑作用和经济价值。

本次试验结果显示，PRVR株在RK13细胞上出现病变时间最早，但病毒含量较低，收获时间也不适合大规模生产，需要下班时间操作。ST细胞病毒含量最高，收获时间也方便工人操作，降低生产成本，适合大规模生产。其他3种细胞在病毒含量介于前二者之间，可作为研究和生产病毒的替代细胞。因此建议将ST细胞作为培养PRVR株病毒液的工作细胞，可满足大规模病毒液的产能需求，也无需产生额外的加班。