陈乃东

皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012

引 言

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)为兰科石斛属植物、 安徽道地药材[1-2]，具有滋阴养胃、 清热生津、 润肺止咳之功效；含多糖[3-6]、 生物碱等[7-8]，具有增强免疫、 明目、 延缓衰老等多种功效[9-11]。近年来，由于需求增加，导致以霍山石斛为代表的石斛类药材价格急剧上升。作为石斛资源综合利用的一部分，将石斛的鲜花干制成花茶，作为保健饮料日渐为市场接受。然而，由于产量、 口感与药理活性的差异，不同来源的石斛花茶，价格差异显著，其中以霍山石斛花茶价格最高，市场价近3 000～5 000元·kg-1。在经济利益驱使下，市场上以价格较低的铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo.)、 河南石斛(DendrobiumhenanenseJ. L. Lu et L. X Gao)[2]花茶冒充霍山石斛花茶时有发生，急需构建霍山石斛花茶与铁皮石斛、 河南石斛花茶鉴定方法。

作为亲缘关系相近的石斛属植物，霍山石斛与铁皮石斛、 河南石斛鲜花的形态相近[2]，形态学上主要区别在于铁皮石斛与河南石斛花的唇瓣有一紫色斑块，而霍山石斛花的唇瓣白色、 无斑块[图1(a,b,c)]。当加工成花茶后，铁皮石斛与河南石斛花唇瓣上的紫色斑块消失[图1(d,e,f)]，极大提高了鉴别难度。

图1 霍山石斛(a, d)、 铁皮石斛(b, e)、 河南石斛(c, f)花及其花茶Fig.1 The flowers and the flower tea of D. huoshanense (a, d), D. officinale (b, e) and D. henanense (c, f)

中药材粉末的红外光谱具有一定的“指纹”性，借助红外特征吸收谱图的差异可达到区分和鉴别中药材的目的。将包括一维红外光谱(ATR-FTIR谱)、 二阶导数光谱(SD-IR谱)、 二维红外光谱(2D COS IR谱)的多级红外光谱技术，用于中药材的真伪鉴定及其质量控制，可极大提升红外光谱区分复杂样品间细微差别的能力[12]。有鉴于此，本实验拟采用多级红外光谱技术，建立三种石斛花茶基于ATR-FTIR谱、 SD-IR谱以及温度微扰2D COS IR谱的多级红外指纹图谱，探讨霍山石斛花茶与铁皮石斛、 河南石斛花茶的区别，构建快速、 高效的霍山石斛、 铁皮石斛、 河南石斛花茶多级红外鉴定方法，为霍山石斛花茶真伪鉴定与质量控制提供参考依据。

1 实验部分

1.1 样品

实验材料霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶于2018年7月购自霍山、 金寨不同的花茶生产企业不同批次加工的花茶(表1)。103 ℃红外烘箱烘干至恒重，粉碎，过40目筛，备用。

表1 石斛花茶样品Table 1 The Dendrobium flower tea samples

1.2 仪器

傅里叶变换红外光谱仪Nicolet iS50(美国热电)、 YGH-500S/BS红外烘箱(上海跃进医疗器械有限公司)、 FA-1004型电子分析天平(上海精科天平厂)等。

1.3 数据采集

精密称取1.1节制备的霍山石斛、 铁皮石斛、 河南石斛花茶供试品粉末，在4 000～400 cm-1范围内采集ATR-FTIR红外光谱，间隔4 cm-1，每个样品累积扫描16次。然后将不同石斛花茶样品装入变温附件，温度从60 ℃逐步升高至120 ℃，每升15 ℃采集一次ATR-FTIR红外光谱。每个样品重复采集三次光谱，取平均值。实验设5个重复。

1.4 数据分析

利用仪器自带的OMNIC分析软件，对采集的ATR-FTIR谱，进行光滑处理、 自动基线校正、 纵坐标归一化处理后，对每一个样品的五个重复实验测定结果取平均谱，作为该样品ATR-FTIR标准谱。从软件中导出峰位、 峰强等信息，对比分析确定三种石斛花茶的ATR-FTIR特征峰。

利用OMNIC软件对三种石斛花茶的平均ATR-FTIR谱进行二阶导数转换获SD-IR谱，对比分析三种石斛花茶SD-IR谱差异。

基于三种石斛花茶的平均ATR-FTIR光谱及其经过数据转化获得的SD-IR光谱，利用OMNIC软件对不同地区、 不同厂家、 不同生产批次的石斛花茶进行相似度对比研究。

将1.3节采集的温度微扰下的红外谱进行自动光滑、 自动基线校正、 纵坐标归一化等处理后，利用OMNIC软件中的Spectra Corr二维相关分析软件处理，获得温度动态谱即温度微扰2D COS IR谱。分析对比确定三种石斛花茶二维红外光谱存在稳定差别区域，分析在该区域里三种供试品的自动峰的峰位、 峰强，相关峰的峰位及其正、 负性。

1.5 方法学考察

1.5.1 稳定性实验

按1.3节所述方法，随机取1.1节制备供试品1.0 g，每隔2 h采集1次ATR-FTIR谱，连续测定6次，利用OMNIC中相似度分析软件分析6次采集的ATR-FTIR谱相似度均大于99%，提示结果在12 h之内基本稳定。

1.5.2 重现性实验

按1.3节所述方法，随机取1.1节制备霍山石斛花茶供试品6份，每份1.0 g，测其ATR-FTIR谱，用OMNIC中相似度分析软件分析其ATR-FTIR谱的相似度均大于99%；继续按1.3节所述方法，获得2D COS IR谱，收集6个样品的自动峰峰位、 峰强，以及相关峰的峰位、 峰强、 正/负相关性等数据，运用SPSS软件进行相关性分析，6份供试品2D COS IR谱相关系数均大于0.99，表明该方法具有较好的重现性。

1.5.3 精密度实验

从1.1节制备供试品随机取一样品，按1.3节所述方法，重复采集5次光谱，将5个光谱进行相似度分析，相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

1.6 外部验证实验

三种石斛花茶第四批样品DHS25-34，DHN25-34，DO25-34，按1.3节所述方法，采集数据，按1.4节所述方法进行数据分析。

采用基于前三批样品构建的三种石斛花茶鉴定特征，鉴定第四批样品的花茶种类。

2 结果与讨论

2.1 霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶ATR-FTIR谱分析

霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶的ATR-FTIR谱(图2)非常类似，很难从谱线看出三者的区别。基于三种石斛花茶平均ATR-FTIR谱的相似度分析显示(表2)，三种石斛花茶相似度为83.1%～89.7%，提示三种石斛花茶化学成分存在差异。来自霍山、 金寨不同批次的霍山石斛花茶之间的相似度分别为99.1%～99.5%，98.7%～99.1%；来自霍山、 金寨不同批次的铁皮石斛花茶相似度分别为98.1%～98.6%，98.6%～99%；来自霍山、 金寨不同批次的河南石斛花茶相似度分别为97.6%～98.3，97.9%～98.2%，说明产地和批次对三种石斛花茶的品质影响较小。分析各样品ATR-FTIR谱峰位、 峰强等数据后发现，霍山石斛花茶在1 398 cm-1有稳定的特征峰，铁皮石斛花茶在1 542 cm-1有稳定的特征峰，河南石斛花茶在603，703，811，1 332和1 610 cm-1等波数处有特征峰，根据这些ATR-FTIR谱的特征峰，可以初步鉴别三种石斛花茶。

表2 不同石斛花茶基于ATR-FTIR光谱的相似度对比结果Table 3 The similarity coefficients of the 3 kinds of flower tea based on their ATR-FTIR spectrum (%)

图2 三种石斛花茶的ATR-FTIR谱(4 000～400 cm-1)a: 霍山石斛；b: 铁皮石斛；c: 河南石斛Fig.2 The ATR-FTIR spectra of the 3 kinds of Dendrobium flower tea in the range of 4 000～400 cm-1a: D. huoshanense；b: D. officinale；c: D. henanense

2.2 霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶的SD-IR谱分析

基于三种石斛花茶SD-IR谱的相似度分析(表3)可见，三种石斛花茶相似度为70.9%～87.9%，明显低于基于ATR-FTIR谱的相似度，提示二阶导数处理能明显的提高光谱分辨率，一定程度上增加光谱灵敏度。金寨的霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶不同批次间相似度依次为：92.9%～93.9%，90.0%～91.0%，90.9%～93.2%，霍山的霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶不同批次间相似度依次为：92.0%～93.2%，90.3%～93.8%，91.8%～94.6%，进一步证明不同产地和批次的霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶品质相对稳定。三种石斛花茶在1 800～600 cm-1的SD-IR谱(图3)上，可以观察到明显差异：在1 750～1 690 cm-1区间，相对铁皮石斛与河南石斛，霍山石斛花茶SD-IR谱呈明显“M”形；在1 140～1 080 cm-1区间，霍山石斛与河南石斛SD-IR谱呈深“W”型，铁皮石斛呈不规则形；在1 000～930 cm-1区间，霍山石斛花茶SD-IR谱为“M” 形，铁皮石斛与河南石斛花茶呈“W”形。SD-IR谱能更好地分辨ATR-FTIR谱图中的重叠峰，根据三种石斛花茶的SD-IR谱在上述波段的差异，可直接区分霍山石斛花与铁皮石斛花、 河南石斛花茶。

图3 三种石斛花茶SD-IR谱(1 800～600 cm-1)a: 霍山石斛；b: 铁皮石斛；c: 河南石斛Fig.3 The SD-IR spectra of the 3 kinds of Dendrobium flower tea in the range of 1 800～600 cm-1a: D. huoshanense；b: D. officinale；c: D. henanense

表3 不同石斛花茶基于SD-FTIR光谱的相似度对比结果Table 3 The similarity coefficients of the 3 kinds of flower tea based on their SD-FTIR spectrum (%)

2.3 山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶的2D COS IR谱鉴别

图4 三种石斛样品的2D COS IR谱(1 230～1 130 cm-1)(a): 霍山石斛花茶; (b): 铁皮石斛花茶; (c) 河南石斛花茶Fig.4 The synchronous 2DCOS-IR contour plot of different Dendrium samples in the region of 1 230～1 130 cm-1(a): D. huoshanese；(b): D. officinale；(c): D. henanese

表4 三种石斛样品的自动峰及强度Table 4 The auto peaks and their relative intensity on 2D COS IR spectra among the 3 Dendrobium samples. (intensity value: ×10-4)

因此，与ATR-FTIR谱、 SD-IR谱相比，温度微扰2D COS IR谱可显著放大不同石斛花茶样品间差别，表观分辨率明显提高，使得形态学极为相似的霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶很容易区分，可为其鉴别提供可靠依据。在本实验条件下，根据1 230～1 130 cm-1波数范围内2D COS IR谱相关峰的个数、 位置、 强度以及交叉峰的位置、 正负，可以区分霍山石斛、 铁皮石斛与河南石斛花茶。

2.4 外部验证实验结果

通过对比分析，在第四批样品中，均检测出基于前三批样品发现的ATR-FTIR特征峰、 在SD-IR光谱上观察到三种花茶的特异峰型、 在1 230～1 130 cm-1波数范围内2D COS IR谱相关峰，表明本实验构建的多维红外光谱鉴定方法具有良好的稳定性。此外，与近红外光谱鉴定相比，本实验构建的多维红外光谱方法中的SD-IR谱和温度微扰2D COS IR谱，可以提供直观的、 可视的鉴别特征，可为中药真伪鉴定提供候选方法。

3 结 论

采用多级红外光谱法，对霍山石斛花茶与铁皮石斛、 河南石斛茶进行了比较，结果表明采用ATR-FTIR谱、 SD-IR谱和温度微扰2D COS IR谱相结合的多级红外光谱分析方法，可以快速、 准确区别霍山石斛花茶及其常见伪品——铁皮石斛花茶、 河南石斛花茶。本方法虽然存在需要较为专业的仪器设备及数据处理复杂等缺点，但药材用量少、 操作简单、 检测时间短、 重现性好，结果稳定可靠，可为石斛花茶及其他中药材的快速真伪鉴定提供方法，为霍山石斛花茶的品质控制提供思路与参考依据。