王晓霞，于洋洋，马力通，聂智华，王正德，崔金龙，赛华征，赵文渊

1. 内蒙古科技大学化学与化工学院，内蒙古 包头 014010 2. 中国石油大学(华东)化学工程学院，山东 青岛 266580 3. 清华大学生命科学学院，北京 100084

引 言

金霉素(chlortetracycline，CTC)是一种能抑制革兰阳性菌和阴性菌的活性四环素类抗生素。胃蛋白酶(pepsin，PEP)主要存在于胃液中，是一种多肽水解酶[1-2]。当CTC经口服进入胃中后，通常会与胃液中的酶结合，由于CTC分子含有多个具有活性的酚羟基，可能会与胃蛋白酶上的活性基团相互作用，从而使PEP的活性发生改变。近年来，药物小分子与蛋白酶的相互作用吸引了国内外研究学者的广泛关注。Fatemeh S. Mohseni-Shahri[3]使用多光谱法和分子动力学模拟，探究了食品添加剂日落黄与PEP的结合机理；Mallika Pathak[4]运用多光谱法和热力学计算，研究了二甲双胍与PEP的结合反应。

使用多光谱法与分子对接模拟法研究PEP与CTC之间的相互作用，通过探讨CTC与PEP的相互作用机制，可进一步了解CTC对PEP活性和功能的影响，以及了解CTC在体内的药效动力学和代谢动力学，为改良药物和开发新药提供参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

荧光分光光度计(LS-55，美国PerkinElmer公司)；紫外可见近红外分光光度计(CARY-5000，美国安捷伦科技有限公司)；圆二色谱仪(Chirascan plus，英国应用光物理公司)。

1.0×10-4mol·L-1金霉素(Chlortetracycline Hydrochloride，质量分数为95.3%，中国药品生物制品检定所)溶液；0.1 mol·L-1pH 2.00的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris hydroxymethyl aminomethane，Tris，质量分数≥99.0%)0.5 mol·L-1的NaCl溶液；5×10-4mol·L-1胃蛋白酶(porcine stomach mucose，PEP，纯度≥98%，上海金穗生物科技有限公司)溶液。

1.2 方法

1.2.1 荧光光谱的测定

取十支比色管，分别加入1.0 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再分别加入适量的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)，定容至10 mL，使管内CTC浓度分别为(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5)×10-5mol·L-1。充分摇匀后，置入预先定温好的恒温热水浴中，放置20 min，分别测量各管溶液的荧光光谱，并记录波长范围内发射峰位置及相应荧光强度。根据上述方法，分别测定热力学温度为298，303和308 K条件下的所需数据。

荧光光度计的条件设置: 激发波长(λex)为280 nm，发射波长(λem)范围为300～600 nm，扫描速度为1 500 nm·min-1，狭缝宽为9.0 nm。

1.2.2 同步光谱测定

用荧光光谱法配制比例配制同步荧光所需的待测液，所得待测液中PEP浓度均为5×10-5mol·L-1，CTC的浓度分别为(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1。静置与仪器预热完毕，设置光度计，调节前后狭缝为9.0 nm，扫描速率为1 500 nm·min-1，分别设置发射波长与激发波长的波长差为15和60 nm，分别设发射波长为265和310 nm，激发波长范围为250～550 nm。用比色皿盛取溶液，置入测量部位，扫描待测液，得同步荧光光谱。

1.2.3 三维荧光光谱测定

取两支比色管，分别加入0.5 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再取其中一支加入1.0 mL的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)。放入298 K的恒温水浴锅，静置20 min，待测。

荧光光度计预热20 min，再调至三维荧光功能区，设置前后狭缝为7.0 nm，激发波长范围为200～400 nm，间隔为5.0 nm，扫描200～500 nm范围内的发射光谱，扫描速度为1 500 nm·min-1。待测溶液放入比色皿，测出光谱后导出数据。

1.2.4 紫外可见吸收光谱的测定

取十支比色管，分别移取1.5 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再分别加入适量的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)，使管内CTC最终浓度分别为(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1。摇匀后静置20 min，置入25 ℃恒温水浴锅中20 min。设置扫描吸收波长范围为190～500 nm，扫描速度为300 nm·min-1。记录CTC和PEP体系的紫外光谱。

1.2.5 结合距离的测定

在三支比色管中，分别配制PEP的浓度1.0×10-5mol·L-1、 CTC浓度为1.0×10-5mol·L-1和PEP和CTC浓度均为1.0×10-5mol·L-1的溶液。放入298 K的恒温水浴锅，静置20 min。对CTC溶液进行紫外测定，对PEP溶液和CTC-PEP混合液进行荧光测定。荧光光度计参数: 激发波长为280 nm，发射波长扫描范围为290～550 nm，狭缝设为8.0 nm，扫描速度为500 nm·min-1。紫外可见吸收光度计参数: 扫描范围为190～500 nm，扫描间隔为0.5 nm。扫描速度为300 nm·min-1。

1.2.6 圆二色光谱的测定

在两支比色管中，准确移取1.0 mL的PEP溶液、 1.0 mL的PEP溶液加4.0 mL的CTC溶液，蒸馏水定容至10 mL，得到溶液中PEP浓度均为1×10-5mol·L-1，CTC的浓度分别为0和4.0×10-5mol·L-1，待测。

仪器狭缝宽度调为10.0 nm，设扫描波长范围为180～260 nm，扫描时长为0.5 s。以Tris-HCl溶液为参比，记录CTC和CTC-PEP体系的圆二色光谱。

1.2.8 分子对接模拟技术

蛋白质数据库RCSB Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/ home/home.do)选取PEP晶体结构(蛋白质编码: 3utl)，由Chem office 15.1软件画出CTC的分子结构式，利用分子对接软件DS2016Client作出分子对接模拟图。

2 结果与讨论

2.1 CTC对PEP的荧光猝灭光谱

PEP是由多种氨基酸脱水缩合而成，其中三种芳香氨基酸(色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸)使PEP具有内源性荧光[5]。图1(a,b,c)分别为298，303和308 K温度时，固定浓度的PEP随CTC浓度增大的荧光强度变化情况。由图1(a,b,c)可知，在激发波长280 nm下，PEP的最大发射波长为344 nm，随着CTC浓度的增加，PEP的荧光强度呈现出有序的下降，而发射光谱峰位置移动不明显，由此可知CTC对PEP的荧光强度产生了猝灭效应，两者之间发生了反应。

图1 不同温度下CTC-PEP体系的荧光发射光谱图Fig.1 Fluorescence emission spectra of CTC-PEP system under different temperature(a)：298 K；(b)：303 K；(c)：308 Kc(PEP)=5.0×10-5 mol·L-1；c(CTC)(1—10)：(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；pH 2.00

2.2 CTC对PEP的荧光猝灭类型的判断

动态荧光猝灭中，猝灭分子与荧光分子发生碰撞或能量转移，使荧光分子不发射荧光就直接返回基态，故猝灭效果与激发的单个荧光分子寿命、 猝灭剂实际浓度和所处温度有关，相关运算可使用Stern-Volmer方程[6]

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中：F0是无CTC存在时荧光体PEP的荧光强度；F是加入CTC溶液后荧光体PEP的荧光强度；[Q]是CTC溶液的实际最终浓度；KSV是动态猝灭常数；KLB是静态猝灭常数；Kq为动态荧光猝灭速率常数；τ0是无猝灭剂时生物体内大分子的内源性荧光寿命，生物大分子的τ0约为10-8s[6]。假设CTC对PEP引起的猝灭方式是动态猝灭，则CTC对PEP的猝灭规律适用于Stern-Volmer方程。本实验研究了在298，303和308 K三个温度下CTC对PEP荧光猝灭的影响。以CTC浓度[Q]为横坐标、F0/F为纵坐标进行作图，得到Stern-Volmer曲线见图2，并求得KSV及Kq值列入表1。

图2 三个温度CTC-PEP体系的荧光猝灭的Stern-Volmer曲线Fig.2 Fluorescence quenching of Stern-Volmer curve of CTC-PEP system at three temperatures

根据表1中298，303和308 K下的Kq≈1013L·(mol·s)-1，都远大于动态猝灭最大速率常数2.0×1010L·(mol·s)-1[7]，表明CTC主要通过静态猝灭的途径来减弱PEP的荧光强度。静态猝灭中，温度升高会使其猝灭常数KSV降低。由表1可知，在不同温度下CTC-PEP体系的猝灭常数KSV(L·mol-1)：9.425×104(298 K)>8.795×104(303 K)>7.915×104(308 K)，由于KSV随着温度增加逐渐减小，可进一步说明CTC对PEP的猝灭类型为静态猝灭。

表1 Stern-Volmer线性方程和相关系数Table 1 Stern-Volmer linear equations and correlation coefficients

2.3 CTC与PEP的结合常数和结合位点数

利用静态猝灭双对数公式[8]求两者的结合常数和结合位点数

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中：KA是CTC与PEP的结合常数；n是CTC与PEP的结合位点数。以lg[Q]为横坐标、 lg[(F0-F)/F]为纵坐标作双对数图(图3)，拟合直线的斜率是两者的结合位点数lgKA，与纵坐标的截距数值为n，计算结果见表1。

图3 不同温度下lg[(F0-F)/F]-lg[Q]图Fig.3 Polt of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] at different temperature

由表1可知，在298 K时，CTC-PEP体系的结合常数KA=4.345×107L·mol-1，n=1.618，在303 K时，CTC-PEP体系的结合常数KA=2.836×107L·mol-1，n=1.587，在308 K时，CTC-PEP体系的结合常数KA=1.734×107L·mol-1-n=1.555。可见，三个温度时的CTC与PEP结合常数KA很大，且结合位点数n都接近于1，其证明CTC 与PEP之间的结合作用较强，所得到的复合物也均为1∶1型。同时CTC与PEP的结合常数大小排列为：KA(298 K)>KA(303 K)>KA(308 K)，这显示CTC与PEP的结合常数KA在一定温度范围内与温度呈负相关，这与猝灭常数KSV与温度的关系具有一致性，进一步表明CTC对PEP荧光猝灭模式为静态猝灭。

2.4 CTC和PEP相互作用的热力学参数和主要作用力

Ross理论中的论断可判断出结合反应的实际作用力[9]：当ΔH>0，ΔS>0时，作用力为疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0时，作用力为氢键和范德华力；ΔH<0，ΔS>0时，作用为静电作用力。

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(3)

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(5)

运用式(3)—式(5)，根据Van’t Hoff公式[10]，计算出298，303和308 K下热力学参数焓变ΔH=-70.13 kJ·mol-1，熵变ΔS=-89 J·(mol·K)-1，吉布斯自由能ΔG=-43.57 kJ·mol-1(298 K)，-43.23 kJ·mol-1(303 K), -42.68 kJ·mol-1(308 K)。可知，ΔH<0，ΔS<0，可推测出CTC与PEP间主要作用力是范德华力和氢键，ΔG<0可说明CTC对PEP的静态猝灭为自发、 放热(ΔH<0)的结合过程。

2.5 CTC- PEP体系的结合距离

根据Förster’s[11]非辐射能量转移理论，激发体和吸收体之间的能量迁移率E与两者结合距离r及临界能量迁移距离R0存在以下关系

(6)

(7)

J=∑FD(λ)εA(λ)λ4Δλ/∑FD(λ)Δλ

(8)

式(6)—式(8)中：r为CTC与PEP之间的结合距离；R0代表E=50%时的临界能量转移距离；k2是偶极空间取向因子，一般取平均值2/3；n为介质中的光折射指数，通常取水和有机物的平均值1.36；φ为PEP的荧光量子产率，常取色氨酸残基量子产率φ=0.15；J为PEP的发射光谱与CTC紫外吸收光谱的重叠积分；FD(λ)为PEP在各个波长下的荧光强度；εA(λ)为CTC在各个波长下的摩尔吸光系数，FD(λ)与εA(λ)计算所用波长一致。

图4为CTC与PEP的浓度比为1∶1时，CTC的紫外-可见吸收光谱曲线与PEP的发射光谱曲线的重叠图，代入式(6)—式(8)积分求得两光谱重叠积分J=3.409×10-14cm3· mol·L-1，E=42.96%,R0=3.091 nm，r=3.240 nm。0.5R0

图4 PEP的荧光光谱曲线(a)与CTC的紫外吸收光谱曲线(b)重叠图Fig.4 Overlapping of the fluorescence spectra of PEP (a) with the absorption spectra of CTC (b)a: c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1；b: c(CTC)=1.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6 CTC对PEP二级结构的影响

2.6.1 CTC对PEP作用的紫外可见吸收光谱分析

动态猝灭的荧光物质的吸光度一般不受其猝灭剂影响[12]，图5中随着CTC浓度增大，PEP的紫外吸收峰逐渐增大，证明两者发生了相互作用，且进一步证明静态猝灭发生在CTC与PEP之间。发生红移现象显示嵌入的CTC药物分子与PEP酶的碱基对π电子发生相互作用，使π→π*跃迁更易进行，吸收的光波能量降低。上述现象，说明CTC使PEP分子二级结构的构象发生了变化。

图5 CTC与PEP的紫外可见吸收光谱图Fig.5 UV-Visible absorption spectrum of CTC with PEPc(CTC)(1—10)；(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；c(PEP)= 5.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6.2 CTC对PEP作用的同步荧光光谱分析

当Δλ为15 nm时，同步荧光光谱可显示PEP中酪氨酸(Tyr)残基的荧光光谱特性；Δλ为60 nm时，可显示PEP中色氨酸(Trp)残基的荧光光谱特性[13]。

图6(a)为在Δλ=15 nm时的CTC-PEP同步荧光光谱，图6(b)为在Δλ=60 nm时CTC-PEP的同步荧光光谱。从图6中可知，在PEP存在的环境中，酪氨酸(Tyr)残基的荧光光波峰波长并没有受CTC浓度的影响，且荧光强度变化微弱，峰型基本不变；但色氨酸(Trp)残基的发射峰随着CTC浓度的增大荧光强度显著减小，而且红移了2.5 nm，证明CTC使PEP的色氨酸残基微环境极性增加、 亲水性增加和疏水性减弱，引起PEP二级结构构象改变。

图6 CTC与PEP的同步荧光光谱图Fig.6 Synchronous flourescence spectra of CTC and PEP(a): Δλ=15 nm；(b): Δλ=60 nmc(PEP)=5.0×10-5 mol·L-1；c(CTC)(1—10): (0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6.3 CTC与PEP的三维荧光光谱分析

图7(a)和(b)为PEP和 CTC-PEP体系的三维荧光光谱图及等高线图。“山脊”状的PEAK a和PEAK b是瑞利散射峰(λex=λem)；“驼峰”形状的PEAK 1和PEAK 2是典型的荧光峰(2λex=λem)，PEAK 1显示残基Trp和残基Tyr的荧光光谱特征[13]，PEAK 2主要与多肽骨架结构有关，其强度与蛋白二级结构相关。由表4可知，加入CTC后，峰1(PEAK 1)的荧光强度降低且最大发射波长红移了3.0 nm，峰2(PEAK 2)的荧光强度降低且最大发射波长红移了0.5 nm。荧光强度的降低显示CTC对PEP发生了猝灭作用。红移现象则证明CTC影响了PEP的周围微环境，CTC使PEP周围的微环境的极性增大、 亲水性增强和疏水性降低，且CTC使PEP的肽链结构发生变化。综合上述，CTC使PEP的二级结构发生了变化。

图7 PEP与CTC相互作用前(a)后(b)的三维荧光光谱Fig.7 The three-dimensional fluorescence spectra of BSA and CTC before (a) and after (b)reaction(a)：c(PEP)=2.5×10-5 mol·L-1；(b)：c(PEP)=2.5×10-5 mol·L-1，c(CTC)=1.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 7.40

表2 PEP和CTC-PEP的三维激发发射荧光光谱特征参数Table 2 Three-dimensional fluorescence spectra characteristic of PEP and CTC-PEP

2.6.4 CTC对PEP作用的圆二色谱分析

为进一步研究CTC对PEP 构象的影响，扫描PEP与 CTC-PEP体系的圆二色谱。由图8可知，PEP在200 nm处具有一个负峰，这个负峰是PEP的β-折叠特征峰，吸收峰的强度可以反映蛋白酶β-折叠(β-sheet)含量的变化。将圆二色谱值导入CDNN软件，经过计算得出CTC和CTC-PEP体系的各二级结构占比。当PEP与CTC的浓度比为c(PEP)∶c(CTC)=1∶8时，PEP的β-折叠(β-sheet)占比从47.3%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)降到28.2%。同时，PEP的α-螺旋(α-Helix)占比从11.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到21.0%，β-转角(β-Turn)占比从19.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到24.2%，无规则结构(Random coil)占比从27.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到34.2%。上述结果均表明CTC对PEP发生了相互作用，改变了PEP周围的微环境，导致PEP的二级结构发生变化。

图8 CTC与PEP相互作用的圆二色谱图Fig.8 The circular dichroism spectra of PEP interacting with CTCa：c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1；b：c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1，c(CTC)= 8.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.7 CTC与PEP的分子对接模拟

为了判断CTC对PEP相互作用形式，利用分子对接软件进行对接模拟来预测两者作用力形式及特定距离，利用程序生成CTC对PEP的对接模拟见图9。由图9(a)和(b)可知，CTC分子进入到PEP的表面活性中心凹槽处。为进一步观察CTC与PEP相互作用的微环境，作出CTC附近的氨基酸残基2D/3D示意图9(c)。

图9(c)中，CTC与GLU13，GLY217，ASP32，ASP215和GLY76等氨基酸残基形成氢键，其键长分别为3.393，3.127和3.456，2.578，3.110，2.283 Å。其中，GLY217残基与CTC形成2个碳氢键(Carbon Hydrogen Bond)。CTC与PEP的残基VAL30，SER35，TYR189，THR74，THR77，GLY78和LEU112通过范德华力相互作用。CTC还与残基TYR75之间存在疏水作用力，其作用形式为π-烷基(Pi-Alkyl)，键长为4.851 Å。除了上述作用力，CTC还与残基ILE120，ASP32，GLY34，TYR75，PHE111，LEU112和PHE117之间存在不利碰撞作用力(unfavorable bump)，键长分别为3.631，3.643与4.589，2.091与3.451，3.240，4.080，4.391 Å。这一切均能说明CTC通过各种作用力与PEP稳定结合，CTC与PEP之间的作用力主要是氢键与范德华力，且说明CTC使PEP二级结构微环境变化。

图9 CTC与PEP结合的分子对接结构模型图(a)：CTC与PEP的分子对接模拟图；(b)：CTC与PEP的飘带状分子对接模拟图；(c)CTC与PEP的氨基酸残基2D，3D示意图Fig.9 The docking result of CTC with PEP(a)：Molecular docking simulation of CTC and PEP；(b)：Streamer shape molecular docking model diagram of CTC and PEP；(c)：2D/3D diagram of amino acid residues of CTC and PEP

3 结 论

探究了PEP-CTC在298，303和308 K温度下的荧光发射光谱，证明两者发生相互作用，CTC使PEP荧光猝灭。Stern-Volmer方程计算得到三个温度下的Kq≈1013L·(mol·s)-1，显示CTC对PEP的荧光猝灭形式为静态猝灭。静态猝灭双对数公式计算的三个温度下的两者的结合常数和结合位点数，证明CTC与PEP之间的结合较强且复合比为1∶1型，也进一步证明CTC对PEP猝灭反应为静态猝灭。由Van’t Hoff公式结合Ross理论推断出PEP-CTC的主要作用力形式为氢键和范德华力，其结合过程是自发、 放热的反应。利用Förster’s偶极-偶极非辐射能量转移理论，计算出结合距离r=3.240 nm，证明非辐射能量转移出现在CTC与PEP之间并导致PEP荧光猝灭。经过分子对接，由模拟结果可知CTC对PEP残基的作用方式不仅具有氢键和范德华力，还存在疏水作用力，CTC通过各种作用力与PEP稳定结合。通过CTC-PEP的紫外-可见吸收光谱分析，PEP的吸收峰发生一定的红移，证明PEP的分子构象发生改变，进一步证明CTC与PEP之间发生了荧光静态猝灭。利用波长差分别为15和60 nm的同步荧光法观察PEP中特定氨基酸，可知CTC的加入使色氨酸(Trp)残基附近微环境极性变大，导致PEP的构象变化。利用三维荧光光谱法对CTC-PEP体系分析可知，CTC对PEP的荧光强度产生猝灭，同时证明CTC降低荧光分子的微环境极性并改变其肽链结构，进一步证实了PEP二级结构的变化。通过圆二色谱法分析CTC-PEP体系，并利用CDNN软件计算出各二级结构含量值，二级结构含量的明显变化充分说明CTC使PEP的结构发生了改变。这些结果阐明了在分子结构层面上CTC在胃中的作用机理，进一步揭示金霉素(CTC)在人体内的转运过程及吸收特性，为新药的研发和相关药物的改性提供必要的信息。