周玉兰 朱文超 石冰 贾仲林

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心

四川大学华西口腔医院唇腭裂外科，成都 610041

唇腭裂（cleft lip with or without cleft palate，CL/P）是人类最常见的颅面部先天性畸形之一，统计数据显示全世界每700个新生儿中就有一个唇腭裂患者[1]。在中国，其发病率约为1.67‰[2]。根据有无其他全身性先天畸形的伴发，可以将其分为综合征型唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）[3]。SCL/P表型较NSCL/P复杂，大多符合孟德尔单基因遗传模式；约70%的CL/P为NSCL/P，患者无身体其他部位的畸形，是由多基因突变、有害环境因素及其相互作用导致的复杂疾病[3]。只有当多种危险因素的共同作用达到阈值时，NSCL/P才会发生。NSCL/P的易感基因和区域逐渐被发现，候选基因不断增多。在目前已发现的众多候选基因和信号传递通路中，研究较多的有干扰素调节因子6（interferon regulatory factor-6，IRF-6）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-3、同源异性盒基因1（Msh homeobox1，MSX1）、甲状腺转录因子1（forkhead box E1，FOX-E1）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）家族、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4、 v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（v-maf musculoaponeurotic fi bro sarcoma oncogene homolog B，MAFB）、锌指蛋白（zinc finger protein，ZNF）533、ABCA4（ATP binding cassette subfamily A member 4）、VAX1（ventral anterior homeobox 1）、SPRY2（sprouty RTK signaling antagonist 2）等基因[4-13]。

血小板源性生长因子C（platelet-derived growth factor-C，PDGF-C）属于血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）家族成员，通过PDGF受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGF-R）-α和α二聚体信号通路在胚胎和出生后发育过程中参与多种细胞功能。研究[14]表明，rs28999109位点位于4q32，即PDGF-C基因的调控区域，与NSCL/P发生密切相关。PDGF-C基因敲除小鼠模型出现了腭裂表型，表明PDGF-C基因在腭形成中具有作用[15]。Wu等[16]纳入214个唇腭裂患者—父母三人家系，研究发现24例患者有CL/P阳性家族史，TDT分析表明PDGF-C的rs17035464位点的A等位基因在母系遗传过剩，而父系遗传不足，提出PDGF-C基因与NSCL/P之间存在关联。目前尚未见PDGF-C基因与中国西部汉族人群NSCL/P发生的相关性报道。

另外，环境因素在NSCL/P发生中占据重要地位这一理论也得到了大量研究的证实，但其与遗传因素在NSCL/P发生过程中是否存在交互作用的研究较少。Zeng等[3]纳入294个NSCL/P家系及183个对照家系，研究发现妊娠前3个月吸烟环境、感冒史、饮酒史是患NSCL/P的危险因素，而母亲补充钙是一个保护因素，并未发现EYA1基因与环境因素存在相互作用的证据。研究[17]表明，妊娠前3个月母体暴露于农毒素环境与GREM1基因rs16969816位点之间有显著的交互作用；孩子携带A等位基因和母亲孕期暴露于农毒素环境，与未暴露者相比，其患NSCL/P风险显著增加。学者[18]提出，孕妇被动吸烟是NSCL/P的危险因素；孕妇补充多种维生素是一个保护因素；BMP4基因T538C位点与母体被动吸烟具有协同效应，为NSCL/P由遗传和环境因素共同决定提供了新的证据。孕期适当的叶酸摄入、适当的生育年龄和文化程度高是NSCL/P的保护因素，而家族史、流产史和孕期的药物滥用是NSCL/P的有害因素[19]。但是，目前国内外学者对PDGF-C基因与环境暴露因素之间是否存在交互作用尚无研究。

由于NSCL/P遗传异质性的存在，本研究从人类基因组计划数据库中选取PDGF-C基因杂合度大于20%的2个靶向单核苷酸多态性（single nucleo tide polymorphisms，SNPs）位点（rs4691383和rs7667857）进行遗传统计学分析，探讨中国西部人群中PDGF-C基因与NSCL/P发生的相关性；同时，本研究还对患者母亲孕期情况进行调查，对PDGF-C基因的2个SNPs位点基因型和环境暴露因素之间是否存在交互作用进行条件Logistic回归分析，探讨在NSCL/P发生中基因—环境暴露因素是否存在相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象和实验设计

收集2011年3月—2018年4月于四川大学华西口腔医院唇腭裂外科住院手术治疗的268个NSCL/P病例—父母核心三人家系（表1）。所有研究对象均属于中国西部地区汉族人群，且符合先天性NSCL/P诊断标准，不合并其他先天畸形或先天性疾病。签订书面知情同意书后，采集患者及其父母外周静脉血5～6 mL。另外再同期收集纳入研究的268例患者的母亲填写《唇腭裂流行病学研究问卷表》，舍弃无效资料，将有效资料数据录入资料库，对PDGF-C基因的SNPs位点基因型和环境暴露因素（孕妇吸烟/被动吸烟、叶酸补充史、环境有害气体长期吸入史）之间是否存在交互作用进行条件Logistic回归分析。本研究及研究过程中所需操作均获得伦理委员会的批准。

表1 NSCL/P分类情况表Tab 1 Classif i cation of NSCL/P

1.2 SNPs位点的选择和基因分型

PDGF-C基因位于染色体4q32区域，在International HapMap Project数据库中查询PDGF-C基因的CHB（Han Chinese in Beijing，China）部分典型SNPs图，选择位于PDGF-C基因结构中分布较远且杂合度大于20%的2个靶向SNPs位点（表2）。PDGF-C基因分型采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）—限制性酶切片段长度多态法和直接测序法，均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。所选SNPs位点信息及PCR引物序列见表3。

表2 PDGF-C基因选用的SNPs情况Tab 2 Selected SNPs of PDGF-C gene

1.3 数据统计分析

采用SPSS 20软件对患者及双亲rs4691383位点和rs7667857位点进行哈温平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium）检验。采用Haploview软件对rs4691383位点和rs7667857位点进行连锁不平衡 （linkage disequilibrium，LD）分析，并采用Family Based Association Test（FBAT）1.7.2软件对父母至少一方为杂合子的家庭进行传递不平衡检验（transmission disequilibrium test，TDT）和单倍型关联分析（haplotype association），检测等位基因在父母和患者之间的传递情况。对PDGF-C基因和环境暴露因素之间是否存在交互作用进行条件Logistic回归分析。

2 结果

2.1 哈温平衡检验

rs4691383位点和rs7667857位点双亲的基因型频率测量值和期望值无统计学差异（P＞0.05），符合哈温平衡，具有群体代表性。

表3 PDGF-C SNPs位点PCR引物序列、温度及产物片段长度Tab 3 PCR primers, temperature and product fragment length of the SNPs at PDGF-C

2.2 LD分析

利用FBAT软件进行LD分析，结果表明：D'=0.05，说明rs4691383与rs7667857位点间发生过重组；r2=0.012，说明rs4691383与rs7667857位点具有统计学意义。

2.3 TDT分析

将双亲中含有杂合子的家系进行TDT分析（表4），在NSCLP、NSCPO、NSCL/P组内，rs4691383和rs7667857两个位点传递的A等位基因频率与未传递的A等位基因频率均存在统计学差异（P＜0.05），传递与未传递的G等位基因频率也均存在统计学差异（P＜0.05）。

相对危险度分析显示：在NSCL/P的发生过程中，rs4691383位点的G等位基因存在传递不足，反之，A等位基因存在过度传递；rs7667857位点的G等位基 因存在过度传递，反之，A等位基因存在传递不足。

表4 PDGF-C基因rs4691383和rs4691383位点TDT分析Tab 4 Allelic TDT results for rs4691383 and rs4691383 SNPs in PDGF-C

2.4 单倍型关联分析

rs4691383和rs7667858位点共可构建4种单倍型，利用FBAT软件关联分析各单倍型与NSCL/P的相关性（表5）。其中A-A（P＜0.05）、A-G（P＜0.01）和G-A（P＜0.01）3种单倍型具有统计学意义。在所有rs4691383参与构成的具有统计学意义的单倍型中，均包含rs4691383位点的A等位基因。

2.5 孕早期环境危险因素的条件Logistic回归分析

孕妇吸烟/被动吸烟、叶酸补充史、环境有害气体长期吸入史和PDGF-C基因型的条件Logistic回归分析结果见表6～8。结果表明，孕妇吸烟/被动吸烟史、叶酸补充史、环境有害气体长期吸入史这3个环境暴露因素与PDGF-C基因的SNPs位点基因型之间均不存在交互作用。

表5 SNPs的单倍型分析Tab 5 Haplotype analyze of SNPs

表6 吸烟/被动吸烟和PDGF-C基因型条件Logistic回归分析Tab 6 The results of conditional Logistic regression analysis between smoking/passive smoking and the PDGF-C genotype

3 讨论

NSCL/P具有显著的遗传异质性，由易感基因与孕期环境因素联合致病。PDGF-C基因（157.89～158.12 Mb）位于4q32.1，属于PDGF的家族成员之一[20]。Choi等[14]研究发现，位于PDGF-C调节区域的rs28999109位点的T等位基因与中国人群的CL/P发生之间存在正相关，揭示了PDGF-C基因与NSCL/P发病密切相关。SHH、PDGF、WINT等基因介导的信号通路中断可导致颅面部发育异常。Hoch等[21]研究表明，PDGF基因的信号通路在腭板吸引神经嵴细胞进入形成腭的过程中起重要作用，提示PDGF-C基因敲除小鼠出现腭部发育不良是由于神经嵴细胞迁移进入上腭板架障碍所致。在斑马鱼实验中microRNA Mirn140在腭发育过程中负调控PDGF信号通路，为PDGF基因如何导致腭裂形成提供了一种机制，也揭示了PDGF-C基因可作为NSCL/P的候选基因[22]。条件性PDGF-C基因敲除小鼠研究[23]表明，PDGF-C基因表达的缺失会导致胚胎缺陷，包括腭部融合障碍，因此提出PDGF-C基因在腭发育中的作用突出。研究[15]表明，PDGF-A和PDGF-C信号均通过PDGFRA调控颅面结构、神经管和中胚层器官的发育，其异常会出现口面裂、脊柱裂、肾皮质间质缺乏以及骨骼血管缺陷等畸形，更加证实了PDGF-C基因与NSCL/P发生密切相关。

表7 叶酸补充史和PDGF-C基因型条件Logistic回归分析Tab 7 The results of conditional Logistic regression analysis between the history of folic acid supplementation and the PDGF-C genotype

表8 环境有害气体长期吸入史和PDGF-C基因型条件Logistic回归分析Tab 8 The results of conditional Logistic regression analysis between the long history of inhalation of environmental harm ful gases and the PDGF-C genotype

本研究意在探索PDGF-C基因SNPs位点与中国西部汉族人群NSCL/P发生的相关性。在International HapMap Project数据库中选择位于PDGF-C基因结构中分布较远的2个SNPs位点（rs4691383位点和rs7667857），且杂合度大于20%（rs4691383为0.463，rs7667857为0.273），优于其他SNPs位点，十分具有代表性。本研究患者双亲的基因型频率分布符合哈温平衡，具有群体代表性。TDT结果表明，rs4691383位点A等位基因存在过度传递，是NSCL/P发生的危险因素；rs7667857位点G等位基因过度传递，是NSCL/P发生的危险因素；A等位基因传递不足，是保护性因素。本研究证实PDGF-C基因rs4691383和rs7667857位点与中国西部人群NSCL/P发生具有相关性。LD分析结果显示，D'值＜1，说明2个SNPs位点间发生过重组，存在一定程度的连锁；r2＜1，说明rs4691383与rs7667857位点具有统计学意义。通过FBAT软件对2个靶向SNPs位点进行单倍型分析，发现rs4691383位点的A等位基因所构成的单倍型与NSCL/P有较强的关联性。

遗传因素和环境因素在NSCL/P的发生过程中均发挥着重要作用。本研究对孕期环境因素（有/无吸烟或被动吸烟，有/无叶酸服用，有/无环境有害气体长期吸入）在NSCL/P发生中与PDGF-C基因型的相互作用进行了统计分析。但未发现在NSCL/P的发生过程中PDGF-C基因的2个SNPs位点的基因型与3种环境暴露因素之间存在交互作用。目前国内外对环境因素与NSCL/P发病的相关性有一定研究。Dien等[24]研究表明，孕期母亲被动吸烟与口面裂发生无关，饮用含咖啡因饮料的母亲会增加唇裂患儿的风险，叶酸或多种维生素的充分补充可预防口面裂的发生。Jia等[25]研究发现，补充维生素和叶酸可降低CL/P的发生风险；母亲被动吸烟可增加CL/P的发生风险；加强产前护理，减少环境暴露，可降低CL/P的发生风险。Yin等[26]收集了1 710例唇腭裂患者和956例健康新生儿的《唇腭裂患者流行病学调查》，研究证明孕期母亲吸烟、母亲被动吸烟及母亲饮酒与唇腭裂发生密切相关，分别比对照组患病风险增加了8.776、2.780和2.985倍。另外，本研究纳入的“有或无环境有害气体长期吸入”这一因素，是指母亲生活或工作环境中经常接触脂肪族酸或醛、乙醇醚、三氯乙烯、杀虫剂等有机溶剂或其他污染，其与NSCL/P的相关性也有类似的研究。Zhao等[27]研究发现，在妊娠前3个月，母亲暴露于空气污染（O3，CO，SO2，PM2.5和PM10）会增加子代口面裂的风险。Chevrier[28]研究表明，母亲孕期职业接触有机溶剂混合物，会增加后代发生NSCL/P的风险。Aschengrau等[29]研究表明，在妊娠前3个月接触四氯乙烯污染的饮用水（＞40 μg·L-1）的母亲生下患有脊柱裂、唇裂、腭裂和尿道下裂等畸形婴儿的风险增加。以上研究说明，环境因素在NSCL/P发生中作用显著。但本研究尚未发现在NSCL/P的发生过程中PDGF-C基因的两个SNPs位点的基因型与3种环境暴露因素之间存在交互作用。

综上，本研究发现中国西部人群PDGF-C基因单核苷酸多态性与NSCL/P的发生存在相关性，这在一定程度上可以完善中国西部人群唇腭裂发生遗传数据库。虽然环境暴露因素与PDGF-C基因的2个SNPs位点的基因型之间的交互作用尚未得到证实，但环境暴露因素单独对NSCL/P发生的作用仍不容忽视。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。