赵军 董重阳 师建平 刘晋 党赢 常虹 海日 李婧

1.内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020 2.南京中医药大学研究生院；江苏 南京 210023 3.内蒙古医科大学中医学院，内蒙古 呼和浩特 010110 4.内蒙古医科大学附属医院中医科，内蒙古 呼和浩特 010050

骨质疏松症(osteoporosis，OP)以骨量低下，骨微结构破坏，骨脆性增加，易发骨折为特征的全身性骨病[1]。2001年美国国立卫生研究院将OP定义为骨强度下降、骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病[2]。OP分原发性、继发性两类。原发性OP临床常见，包括绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)(Ⅰ型)、老年OP(Ⅱ型)、特发性OP(包括青少年型)。PMOP即Ⅰ型原发性OP，以进行性骨丢失、骨小梁退行变、骨质疏松、骨脆性增加、骨折风险增加为临床特征的全身疾病，具有发病率随绝经年限延长而增高特点[3]。本病常见多发于绝经后(自然绝经、手术绝经)妇女，主因绝经后卵巢功能衰竭。卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，骨钙素分泌减少，破骨细胞作用增强致骨吸收加快；雌激素水平下降抑制甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)分泌，继发甲亢，肾维生素D失活，从而使1，25(OH)2D3生成减少，肠吸收钙功能下降，骨矿摄入量不足终致骨合成减少[4]。PMOP骨吸收与骨形成均加快，按骨重建异常病理分类，PMOP属高转换型[5]。

蒙医典籍《观者之喜》“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以补为主，补暖补精，而抑赫依过剩……”。老年人属“体热趋于减弱，显示赫依优势”体质[6]，此时体内“赫依”体素过剩，使体内“三根、七素”平衡失调，分解、吸收、排泄功能紊乱，精华、糟粕分解不充，骨精减少，发生骨枯症[7]，骨脆性增加易骨折。蒙药蓝刺头(Echinops sphaerocephalus L.)味苦，性凉，效稀、柔、钝、轻，有固骨质、接骨愈伤、清热解毒，杀“粘”止痛等效，治筋骨折伤、骨伤热、刺痛、金创、疮疡等[8]。研究显示[9-12]，蒙药蓝刺头可通过雌激素样作用促骨形成，调节骨吸收/骨形成偶联，降低骨转换率，达防治PMOP的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1造模动物、实验药物：造模动物选择6月龄SD系SPF级雌性大鼠84只，购自内蒙古医科大学实验动物中心，许可证：SYXK(蒙)2015-0001。蒙药蓝刺头原药购于内蒙古民族大学附属医院，由内蒙古医科大学方剂学重点实验室制备。辅酶Q10片(Co-Q10)[Eisai卫材(中国)药业有限公司生产，10 mg/片]。淫羊藿(Herba Epimedii)颗粒购于国医堂，北京康仁堂药业有限公司，产品批号：13005361。

1.1.2实验设备与器材：1/1000电子称(生产厂家：凯丰集团有限公司；型号：JA503)；微型电子称(生产厂家：长沙湘平科技发展有限公司；型号：ES-600S)；电子天平(生产厂家：上海海康电子仪器厂；型号：ACS-H1型电子计重称)；Micro-CT(内蒙古医科大学附属医院PET-CT室)。4%甲醛液等由内蒙古医科大学中医学院实验中心提供。造模及取材相关手术器械等耗材。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组、建立模型：按随机原则将大鼠分7组，每组12只，假手术组(Sham)、去卵巢骨质疏松模型组(OVX)、蒙药蓝刺头高剂量组(Echinops-H)、中剂量组(Echinops-M)、低剂量组(Echinops-L)、中药对照组淫羊藿组(HEP)、西药对照组辅酶Q10组(Co-Q10)。大鼠卵巢摘除法(去势)制备PMOP大鼠模型[13]。

1.2.2造模是否成功判定：阴道上皮脱落细胞角化实验[14]；去卵巢术后5 d，所有大鼠连续5 d行阴道上皮脱落细胞角化实验，对比观察动情周期，1次/d。消毒棉签于大鼠阴道转动取脱落细胞-单向涂抹载玻片转移细胞-36%甲醛溶液固定15 min-20%甲基蓝染液中染色45 min-蒸馏水冲片-封片-光学显微镜观察-摄片(见图1)。

图1 不同时期大鼠阴道光镜下图片(×400) A：动情期；B：动情间期Fig.1 Light microscopic images of rat vagina at different stages (×400). A: Estrous period; B: Estrous interval

1.3 给药方法

造模后饲养90 d后给药干预。剂量均据人鼠体重比例、人鼠代谢速率比折算：蒙药蓝刺头高、中、低剂量组给药剂量为：13、6.5、3.25 mg/mL。低剂量组为临床等效剂量，高、中、低剂量比例为4∶2∶1。中药对照组淫羊藿给药剂量、西药对照组辅酶Q10[15-16]均按成人剂量有效量，23.4375、0.0 313 mg/mL。模型组、假手术组给药量以相同计算方式予生理盐水。每日称重记录，观察生命情况。

1.4 标本采集、指标检测

处死取右侧完整股骨，分装于取样杯4%多聚甲醒固定，采用骨密度(bone mineral density，BMD)仪离体骨(股骨近端BMD和股骨总BMD)BMD测定、Micro-CT离体骨定量参数分析、骨微结构三维重建、微观形态学观察。

1.5 数据的统计学处理PH

2 结果

2.1 骨密度测定

(1)与假手术组比较，模型组大鼠股骨近端BMD和全段BMD均明显降低(P<0.05)，股骨全段BMD下降37.13%(P<0.05)，股骨近端下降23.42%。(2)与模型组比较，蒙药蓝刺头高、中、低剂量组、淫羊藿组、辅酶Q10组、假手术组股骨全段、近端BMD均明显增高(P<0.05)。(3)与蒙药蓝刺头高、中、低剂量组比较，BMD计量结果西药对照组辅酶Q10组优于蒙药蓝刺头高、低剂量组，有统计学意义(P<0.05)；西药对照组辅酶Q10组与蒙药蓝刺头中剂量组比，二者无统计学意义(P>0.05)。BMD计量结果淫羊藿组优于蒙药蓝刺头高、低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；淫羊藿组与蒙药蓝刺头中剂量组比，二者差异无统计学意义(P>0.05)。(4)淫羊藿组与辅酶Q10组比较，BMD计量淫羊藿组略占优势，但二者差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 骨形态学计量(Micro-CT)骨微结构测定

Micro-CT扫描三维重建测定各组大鼠右侧股骨组织体积(bone volume，BV)、骨小梁体积分数(bone volume/tissue volume，BV/TV)(%)、骨小梁体积与兴趣区间体积的比值(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)(mm)、骨小梁宽度(trabecular widthness，Tb.Wi)(mm)、骨小梁分离度(trabecular spacing，Tb.Sp)(mm)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)(mm-1)、骨小梁模块因素(trabecular pattern factor，Tb.Pf) (mm-1)值。(1)与假手术组比较，模型组大鼠骨微结构骨小梁立体网状结构异常，骨微结构形态计量学各参数值BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.N均明显降低(P<0.05)；Tb.Sp、Tb.Pf增大(P<0.05)。骨小梁体积密度下降50.0%(P<0.05)。(2)与模型组比较，蒙药蓝刺头高、中、低剂量组、淫羊藿组、辅酶Q10组、假手术组骨微结构骨小梁立体网状结构明显改善(P<0.05)。蒙药蓝刺头中剂量组、淫羊藿组、辅酶Q10组大鼠BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N明显上升(P<0.05)，Tb.Sp、Tb.Pf明显减少(P<0.05)。(3)与蒙药蓝刺头高、中、低剂量组比较，骨形态学计量测定结果辅酶Q10组优于蒙药蓝刺头高、低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；辅酶Q10组与蒙药蓝刺头中剂量组比较，二者差异无统计学意义(P>0.05)。骨形态学计量测定结果淫羊藿组优于蒙药蓝刺头高、低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；淫羊藿组与蒙药蓝刺头中剂量组比，二者差异无统计学意义(P>0.05)。(4)淫羊藿组与西药对照组辅酶Q10组比较，骨形态学计量淫羊藿组略占优势，但二者差异无统计学意义(P>0.05)。见图2～3，表2。

表1 各组大鼠股骨全段、近端骨密度比较

图2 股骨全长冠状位三维重建骨小梁显示 A：假手术组；B：模型组；C：中药对照淫羊藿组；D：蒙药蓝刺头高剂量组；E：蒙药蓝刺头中剂量组；F：蒙药蓝刺头低剂量组；G：西药对照辅酶Q10组Fig.2 Three-dimensional reconstruction of the femoral trabecula in full-length coronal position. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

图3 股骨远端松质骨感兴趣区域定位 A：假手术组；B：模型组；C：中药对照淫羊藿组；D：蒙药蓝刺头高剂量组；E：蒙药蓝刺头中剂量组；F：蒙药蓝刺头低剂量组；G：西药对照辅酶Q10组Fig.3 Location of region of interest in cancellous bone of the distal femur. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

表2 各组大鼠股骨干干骺端松质骨Micro-CT微观结构参数Table 2 Microstructure parameters of the cancellous bone in the metaphyseal femur of rats in each

3 讨论

3.1 大鼠骨密度结果分析

OP由增龄、其他复杂因素引起全身性代谢性骨病，病理损害以骨退行性、微结构改变、单位骨量下降致骨脆性、易发骨折特征。BMD值测量仍是目前OP诊断的首选方式，也是预测骨折发生风险有效指标[17]。骨强度75%～80%由骨量决定，双能X线吸收法测定骨密度值是判定防治OP药物疗效的金标准[18]。近年OP研究深入，Micro -CT、PET-CT扫描已被广泛应用于OP。Micro-CT可通过目标骨骼扫描重建，除可拟和计算BMD值，具有测量骨形态学指标、骨微结构观察等优势。本研究显示大鼠去卵巢术后骨量加速丢失，BMD降低，骨微结构退变，呈OP样骨质特征。传统医药可有效抑制绝经后骨骼骨吸收参数，增加BMD、全身骨矿含量[19]。去卵巢OP模鼠股骨两端主要结构为松质骨，中间段股骨由皮质骨构成，而松质骨骨小梁占表面积大，松质骨表面骨转换比皮质骨高多倍[20]。本研究用双能X线吸收法测假手术组、模型组大鼠BMD。结果显示去卵巢术后各组大鼠BMD下降明显，表现为松质骨、皮质骨骨量相继减少，皮质骨变薄，BMD下降；适当剂量蒙药蓝刺头具有明显抗PMOP作用。

3.2 大鼠骨形态学计量骨微结构(Micro-CT)结果分析

骨组织形态计量学是对骨组织形态结构行定量分析的最佳方式。本研究用Micro-CT对大鼠右侧离体股骨全段扫描，操作平台行全股骨三维重建，设定兴趣区域对骨组织形态学具有代表性指标行测定分析。主要观察BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf等指标变化。BV减小说明骨组织OP样改变越明显；BV/TV与OP样改变程度成正比；Tb.Th、Tb.Wi值越小说明OP样骨质改变越明显；OP骨组织见骨小梁排列稀疏、髓腔增大，Tb.Sp值增大；Tb.N越少，OP样改变越明显；Tb.Pf与骨组织OP样改变呈正相关。结果显示去卵巢术后各组大鼠骨组织体积、骨小梁体积分数、骨小梁厚度、骨小梁宽度、骨小梁数目、骨小梁模块因素下降明显，骨小梁分离度升高明显；适当剂量蒙药蓝刺头可明显提高大鼠骨组织体积、骨小梁体积分数、骨小梁厚度、骨小梁宽度、骨小梁数目、骨小梁模块因素，明显降低骨小梁分离度，具明显抗PMOP作用。

综上所述，本研究从去卵巢PMOP模型大鼠药物干预后骨微结构变化，直观证实蒙药蓝刺头具较强固骨质作用，说明其增强成骨分化、骨形成力，降低骨代谢转换水平，减少骨吸收。研究结果为蒙医药补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨治法经典抗OP理论提供实验依据，也为本病临床防治、衰老相关疾病研究提供新思路，为更深入阐释蒙医“补肾气(赫)-清镇赫依-固骨质壮骨”理论科学内涵提供思路借鉴。