王杰 解莉楠

（东北林业大学生命科学学院 东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

表观遗传学是指基于非基因序列改变导致的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控等。在高等真核生物中，DNA甲基化发生于胞嘧啶第五位碳原子上，是一种重要的表观遗传学修饰，可以调节基因组转录、细胞分化、基因印迹、转座因子沉默等生物学过程［1-5］。DNA甲基化水平由DNA甲基化和DNA去甲基化动态调控，甲基化维持失败和去甲基化酶主动去甲基化都可以影响甲基化水平［6］。

在植物中，DNA甲基化的建立和维持已经得到充分了解，而对于DNA主动去甲基化机制还知之甚少。DNA主动去甲基化不仅对于全基因组表观遗传重编程至关重要，在植物发育过程中还介导基因座特异性基因激活［7］。DNA去甲基化包括DNA主动去甲基化和被动去甲基化2种类型。DNA主动去甲基化不依赖于复制，但是需要一定的酶活性。拟南芥编码4种DNA去甲基化酶，DEMETER（DME）、REPRESSOR OF SILENCING1（ROS1）、DEMETER-LIKE 2（DML2）和 DEMETER-LIKE 2（DML3）［8］。而DNA被动去甲基化依赖于DNA复制，是指复制后缺乏DNA甲基转移酶活性或缺乏甲基供体导致甲基化无法维持。ROS1是首先报道的植物中去甲基化酶［9］，它不仅具有糖基化酶活性，还具有AP裂解酶活性，能切开DNA骨架。研究植物体内ROS1对进一步探究去甲基化具有重要意义。有关研究表明去甲基化酶在细胞分化和转座子沉默中发挥关键作用，影响基因表达和果实成熟［10］，但潜在的酶促机制仍不清楚。本文重点关注去甲基化酶ROS1在植物中的研究进展，总结近几年去甲基化酶ROS1的发现和探究、在主动去甲基化机制方面的研究进展和其在植物发育过程中的功能。

1 植物体中去甲基化酶ROS1的发现和探究

1.1 ROS1具有DNA糖基化酶活性

2002年，巩志忠课题组使用RD29A-LUC（luciferase）系统筛到了参与DNA去甲基化过程的突变体ROS1，且体外证实ROS1具有DNA糖基化酶的活性［9，11］。2006 年，Agius等［12］报道了 ROS1的生化特性及其过表达对靶基因DNA甲基化的影响，表明ROS1是5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶/裂解酶，参与拟南芥中的DNA主动去甲基化，为以后植物中DNA主动去甲基化的研究奠定了基础。后经多项研究，从紫花苜蓿（Medicago truncatula）、菜 豆（Phaseolus vulgaris）、 车 轴 草（Trifolium pratense）、 拟 南 芥（Arabidopsis thalianaColumbia）、鼠 耳 芥（Arabidopsis halleri）、 白 菜（Brassica rapaFPsc）、马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）、 玉 米（Zea mays）、 水 稻（Oryza sativa）、地钱（Marchantia polymorpha）11个物种中克隆获得ROS1的同源基因（图1），进化分析显示ROS1在多个物种中都很保守，表明ROS1在不同物种中都具有去甲基化的功能。

1.2 ROS1主动去甲基化途径

DNA主动去甲基化过程在塑造甲基化模式中起着关键作用，但其中机制仍然不清晰。植物和动物共有5 mC，但DNA去甲基化系统独立进化，具有不同的机制［13］。在植物发育过程中，DNA主动去甲基化是由5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶ROS1家族起始的，其通过碱基切除修复途径启动DNA主动去甲基化［14］，调节真核生物中的DNA甲基化水平。DNA去甲基化酶ROS1在CG、CHH、CHG三种维持型甲基化类型中都具有切除5mC的活性。当其执行去甲基化功能时，先通过水解DNA脱氧核糖核苷酸和碱基之间的糖苷键将甲基化的胞嘧啶去除，然后通过它们具有的裂解酶活性在DNA链上的无碱基位点切开一个缺口（图2）［15］。研究表明ROS1去除甲基化的胞嘧啶碱基后，在无碱基位点通过连续的 β-和 β，δ-切除反应切割其底物 DNA［16-17］。β-切除在DNA链缺口的3'端产生一个3'-PUA（磷酸-α，β结构不饱和醛），β，δ-切除在DNA链缺口的3'端产生一个 3'-磷酸基团［17］（图 2）。3'-PUA 和 3'-磷酸基团分别在相关蛋白DNA磷酸酶ZDP、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE1L的作用下转变为可被下游DNA聚合酶识别的3'-羟基（图2）以便DNA聚合酶和连接酶活性可以填补间隙，再通过DNA连接酶完成去甲基化整个过程，最后在3'末端添加一个未甲基化的胞嘧啶［17-18］。

1.3 ZDP、APE1L与ROS1共同作用DNA主动去甲基化途径

通过使用ZDP特异的抗体在拟南芥叶核中对ZDP进行免疫荧光定位试验，结果表明，核质ZDP信号与ROS1共定位［19］。通过免疫荧光共定位［20］试验，也已证明APE1L与细胞亚群中不同亚核结构中的DNA去甲基酶ROS1在体内共定位。将ROS1与51-mer双链DNA底物（51-mer duplex DNA substrate，在5'-末端标记链的第29位含有5-meC残基）一起孵育并将产物进行纯化分析，显示ZDP催化β，δ-消除产生的3'-磷酸末端转化为3'-羟基；β-消除产生3'-PUA与APE1L蛋白组合产生3'-OH末端。研究发现来自zdp突变体植物的提取物不能在体外完成DNA去甲基化，这些突变使DNA甲基化水平升高，从而导致基因沉默［19］。APE1L具有有效的3'-磷酸二酯酶活性，可有效加工ROS1产生的3'-PUA阻断末端，APE1L功能障碍导致DNA甲基化的全基因组改变，APE1L和ZDP的双突变导致胚乳中DNA高甲基化和印迹基因的下调［18］。在拟南芥中，X射线交叉互补组蛋白1（x-ray crosscomplementing group protein 1，XRCC1） 在 DNA 主动去甲基化过程中起作用，其在体外与ROS1和ZDP相互作用并刺激它们的酶活性［21］，研究发现xrcc1突变体植物的提取物中，去甲基化酶ROS1的去甲基化能力降低。

图1 植物ROS1同源蛋白系统进化

1.4 主动去甲基化过程中DNA连接酶LIG1的发现

ROS1介导的DNA主动去甲基化过程中产生3'羟基后，下游的聚合酶和连接酶可以在这个缺口填充未甲基化的胞嘧啶。迄今为止，在拟南芥DNA主动去甲基化的最后一步中起作用、产生磷酸二酯键并连接DNA链两端的DNA连接酶是AtLIG1（图2），而这个途径中的DNA聚合酶作用尚不清楚。LIG1对于母体印迹基因的去甲基化和活化是必不可少的［22-23］。通过共免疫定位测定，发现AtLIG1与核质灶中的ROS1共定位，与细胞核和核质中的APE1L共定位，与核质中ZDP共定位，表明AtLIG1与ROS1、APE1L、ZDP在DNA主动去甲基化途径中一起发挥作用［23］。杂合突变体atlig1-1（Col背景）和atlig1-3（C24背景）植株的生长发育均出现异常，LIG1的RNAi系也表现出严重的矮化表型，通过亚硫酸氢盐测序证实AtLIG1 RNAi系在CG背景下显示该基因座处的DNA高甲基化，进一步证明AtLIG1是去甲基化过程中的重要组成部分［23］。

图2 碱基切除修复（BER）途径介导植物中DNA主动去甲基化［18］

2 植物体中去甲基化酶ROS1的调节机制

2.1 ROS1靶向DNA主动去甲基化的机制

已有研究表明组蛋白乙酰转移酶增加DNA甲基化 1（Histone acetyltransferase increased DNA methylation1，IDM1）是一种his-tone H3乙酰转移酶（Histone H3 acetyltransferase），是拟南芥中DNA去甲基化的调节因子［24］，在遗传学上与ROS1处于同一途径，在ROS1靶向途径中起作用。

抗沉默蛋白复合物包括IDM1（ROS4）、IDM2（ROS5）、IDM3（Increased DNA methylation2-like1，IDL1）、甲基- CpG结合蛋白7（Methyl-CpG-binding protein 7，MBD7）、先驱转座子衍生蛋白1（Harbinger transposon-derived protein1，HDP1）、 先 驱 转 座 子衍 生 蛋 白 2（Harbinger transposon-derived protein1，HDP2），它们能够分别形成复合物，并在ROS1靶向机制中起作用［25-29］（图2）。MBD7和 HDP2能结合DNA，共同确保IDM1靶向于CG高甲基化区域；IDM2和IDM3在连接IDM1和MBD7中发挥作用；HDP1介导IDM1和HDP2之间的交互；IDM2和IDM3可以作为调节IDM1酶活性的分子伴侣。

染色质重塑复合体（SWR1）的组分包括PIE1、ARP6和SWC6（图2），SWR1复合物可以与2个含溴结构域的蛋白质NPX1和AtMBD9结合［30］。最新研究结果表明含有溴结构域的蛋白质NPX1和AtMBD9识别由IDM1建立的乙酰化组蛋白标记，并有助于将SWR1复合物吸引到染色质上，SWR1复合物中的ARP6和PIE1能将H2A.Z沉积到染色质中，最后H2A.Z与ROS1直接相互作用从而招募ROS1执行主动去甲基化，确定了IDM1复合物起始的植物中DNA主动去甲基化的完整调控途径［30］（图2）。

2.2 ROS1去甲基化水平的调控机制

ROS1的甲基化敏感性表达是保守的，通过调节转录水平响应甲基化水平的改变，从而影响表观基因组稳定性［31］。目前，在ROS1基因启动子中发现了可以感知DNA甲基化和去甲基化活性的39 bp的DNA甲基化监测序列（MEMS），其通过调节ROS1表达动态调控基因组DNA甲基化水平［32］（图3）。MEMS区域的DNA甲基化水平受到ROS1介导的主动去甲基化和RdDM（RNA-directed DNA methylation）途径介导的从头合成甲基化动态调控的严格控制，研究发现当RdDM转录水平高或者去甲基化水平低时，MEMS的甲基化水平增加从而促进ROS1的活性；当RdDm转录水平低或者去甲基化水平高时，MEMS的甲基化水平降低从而抑制ROS1的活性［32］。SUVHs可以与MEMS区域结合，结合程度与MEMS的甲基化水平有关，已有研究证明几个Su（var）3-9同源体（SUVHs）可以检测MEMS区域的DNA甲基化水平，并冗余地促进ROS1的表达［33］。

SUVH家族蛋白和DnaJ结构域蛋白对于调控ROS1启动子中的DNA甲基化水平和激活ROS1转录也很重要［34-35］。通过分析拟南芥全基因组DNA甲基化，发现许多启动子甲基化的基因并没有被沉默，说明除了DNA主动去甲基化，还有另外一种机制可以在不改变DNA甲基化的条件下抵消DNA甲基化和转录沉默，SUVH1（Su（var）3-9同源体）就是这样一种抗沉默因子，在全基因组水平上与高甲基化位点结合，从而直接促进启动子甲基化基因的表达［36］。SUVH1与同源物SUVH3具有冗余功能，有3个与SUVH1或SUVH3相互作用的DNAJ结构域蛋白（SDJ1、SDJ2和SDJ3），这些蛋白形成紧密蛋白质复合物（SUVH-SDJ）共定位在大量的甲基化的启动子中，具有转录激活活性，从而抑制基因沉默，对于植物的生长和发育至关重要［34］。

细胞溶质铁-硫簇聚集途径（Cytosolic ironsulfur cluster assembly，CIA）靶向复合物将Fe-S簇组装成其结合蛋白，CIA1、AE7和MET18是组成细胞溶质Fe-S簇的装配因子，在该复合物中，NAR1与Fe-S簇结合，CIA1是一个蛋白质相互作用的支架，图谱克隆将抗沉默（ASI）因子ASI3鉴定为MET18（图3）。在细胞质中，CIA途径组分MET18直接与ROS1相互作用将Fe-S簇转移至ROS1，从而使ROS1进入核内，通过MEMS检测甲基化水平动态执行去甲基化功能［37-38］（图3）。研究发现MET18突变导致数千个基因组位点超甲基化，其中大多数与ros1和ros1dml2dml3突变体中鉴定的高甲基化位点重叠，说明MET18可能在去甲基化途径中与ROS1一起发挥作用。

图3 通过胞质铁硫团簇组装（CIA）途径和DNA甲基化调控ROS1［39］

DNA甲基化和DNA去甲基化动态调控ROS1的表达。有研究显示DNA修复因子——DNA损伤结合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）通过与RdDM途径的调控因子AGO4相互作用来控制从头合成的DNA甲基化［40］，它刺激甲基化和抑制去甲基化，且能作为ROS1表达的转录抑制因子，从而调节其DNA甲基化水平。据报道，DNA甲基化变化引起的ROS1上调可以导致DDB2功能障碍［41］。DDB2还直接与2个下游DNA去甲基化因子ZDP和APE1L相互作用，并刺激它们的活性［42］。总之，DDB2通过对碱基切除修复途径中上游ROS1和下游ZDP和APE1L的影响在一定程度上调控去甲基化酶ROS1的去甲基化水平。

3 植物体中ROS1主动去甲基化的生物学功能

ROS1生物学功能的探究可以进一步全面了解其生物学功能，对于深入探索去甲基化酶ROS1主动去甲基化具有重要意义。许多研究证明，去甲基化酶ROS1调节多种植物的各类生物学过程（表1）。本文讨论了去甲基化酶ROS1在植物中对印记基因表达及调节种子休眠、调控水稻籽粒品质、气孔发育、病原体防御、盐协迫耐受等方面的作用。

3.1 ROS1负调控印记基因表达和种子休眠

基因组印记是一种表观遗传调控形式，导致母系或父系遗传等位基因的亲本差异表达，胚乳是基因印记的主要场所［43］。已经鉴定出一些植物母系印记基因，如 FWA［44］、MEA［45］、NUWA［46］等。在去甲基化过程中，ZDP、APE1L双突变和AtLIGI突变可导致MEA和FWA被沉默，进而引起早期种子败育，母系致死［17，26］。在水稻4种ROS1同源物之一ROS1a中，母体ROS1a的突变会导致胚乳发育停滞和植物发育不足［47］。

DOGL4是调控种子休眠基因DOG1的同源基因［48］，它是一个胚乳中父本不完全印记基因［49］。在ros1突变体中，DOGL4父本等位基因的表达被完全抑制，而母本等位基因的启动子区域仍保持较低的甲基化水平，从而最终使DOGL4在ros1突变体中变成一个完全的父本印记基因［50］。与母本等位基因相比，DOGL4的父本等位基因由RNA介导的DNA甲基化（RdDM）导致其启动子的-1.0 kb区域甲基化更高从而使父本等位基因表达受到了部分抑制，即ROS1通过对父本等位基因启动子进行去甲基化来负调控DOGL4基因的印记。DOGL4参与负调控种子休眠，并且它在胚乳中的印记表达也对种子休眠和ABA响应的调控起一定的贡献作用，ROS1通过调节DOGL4启动子区域的去甲基化水平正调控DOGL4的表达，且与野生型相比，ros1突变体种子休眠和ABA敏感性增加［50］。

脱落酸（ABA）是一种植物激素，在拟南芥中，ros1突变体在幼苗发育早期和根生长过程中对ABA高度敏感，在该突变体中发现一些ABA诱导基因的表达水平降低，超过60%的近端区域高度甲基化，说明ROS1介导的DNA主动去甲基化可以调控ABA诱导基因［51］。烟酰胺酶 3（NIC3）在 NAD+补救合成途径中编码一种将烟酰胺转化为烟酸的酶，对ABA反应敏感，在NIC3突变体中需要ROS1介导的DNA主动去甲基化在启动子上作为转录激活［51］。

3.2 ROS1同源基因OsROS1调控水稻籽粒品质

淀粉质胚乳主要储存淀粉和糊粉，含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质［52-53］。三倍体谷物胚乳由外糊粉质胚乳和内淀粉质胚乳组成，是人类不可或缺的主食种类［54］。近期，通过创建并利用半粒种子筛选体系筛检了近3万粒水稻种子，获得一个糊粉层增厚的水稻品系ta2，通过基因克隆发现DNA去甲基化酶基因OsROS1显性负突变导致糊粉层增厚，从野生型水稻的一层细胞增加到4-10层，对于拓广禾本科作物营养品质育种具有重要意义［55］。为了提高水稻的营养价值，用正向遗传方法筛选了糊粉蛋白增厚的突变体，除淀粉外，所有测定的营养因子（包括脂类、蛋白质、维生素、矿物质和膳食纤维）的含量在突变体中均有所增加，该突变体具有丰富的营养因子含量，调控OsROS1对于改善水稻育种中的谷物营养有重要意义［55-56］。

3.3 对植物气孔发育的影响

ROS1介导的DNA去甲基化在转基因、转座因子和一些内源基因的调控中起关键作用。然而，在ros1突变体植物中没有关于明确发育表型的报道。控制气孔谱系细胞群的表皮作用因子2（EPF2）属于植物特定的富含半胱氨酸的肽家族，作为气孔形成的负调节物［57-58］。有研究发现，在ros1突变体中，EPF2的启动子区域是高甲基化的，这大大降低了EPF2的表达从而导致气孔增加。去甲基化酶ROS1引发的DNA主动去甲基化在控制植物发育过程中分散的气孔谱系细胞中起作用［59］。

表1 已知DNA去甲基化酶ROS1在植物发育中的功能

3.4 ROS1对病原体防御起作用

研究表明DNA去甲基化在病原体防御中起着不可或缺的作用［60-61］。ros1突变体显示对丁香假单胞菌的易感性增加，这与插入抗病基因启动子的转座子胞嘧啶甲基化升高相一致，该启动子抑制了ros1的表达［61］。利用拟南芥-镰刀形镰刀形孢菌的病理系统，与野生型（WT）植物相比，三重DNA去甲基酶突变体rdd（ros1 dml2 dml3）对这种真菌病原体高度敏感［8］。以上表明DNA去甲基化在细菌和真菌的抗病性中发挥作用。通过对rdd下调基因的组织特异性和致病诱导表达模式研究，结果表明，在拟南芥中的DNA去甲基化（主要由ROS1完成）可以促进防御相关基因的表达［62］。

3.5 在烟草中ROS1过表达对盐胁迫耐受

盐胁迫影响植物的许多生理、生物化学、细胞和分子过程［63］。在植物中，黄酮类和抗氧化途径的酶对于防御盐胁迫的影响有关键作用［64］。在盐胁迫条件下，编码黄酮类和抗氧化途径酶的各种基因的表达增强［65］。研究发现过表达AtROS1增加了类黄酮生物合成途径相关基因和抗氧化途径相关基因的去甲基化水平。在盐胁迫条件下，过表达AtROS1的转基因烟草，这些基因启动子及编码区域的甲基化水平降低，表现出对盐胁迫的耐受性［66］。

4 总结与展望

目前，植物中DNA主动去甲基化有了很多研究进展，ROS1是一种重要的DNA主动去甲基化酶，已经对其糖基化酶的功能和酶活性调节的机制有一定的了解，但仍不全面。ROS1主动去甲基化途径的底端切除修复途径比较明确，ROS1的招募机制也已经提出，但仍未发现DNA聚合酶的相关信息，下游是如何识别并添加未甲基化的胞嘧啶等问题也有待研究。研究表明DME和ROS1在体外具有显著的5hmC切除活性，然而在拟南芥中没有检测到5hmC，说明植物不太可能利用5hmC作为DNA去甲基化的中介，这表明了在植物中DNA去甲基化的替代途径的可能性［67］。已显示生长素在拟南芥中的APOLO基因座处触发DNA主动去甲基化［68］。然而，我们并不知晓在APOLO基因座上连接生长素与活性DNA去甲基化的媒介。植物中是否还存在其他家族的去甲基化酶，是否还有其他的去甲基化途径，都是很有意义的研究方向。

目前，ROS1对植物生长发育影响的研究并不多，对于基因表达的调控、表型的改变、果实成熟等方面的作用仍不清晰，所以ROS1介导的DNA主动去甲基化在植物发育中的影响机制或许会有新的发现。在园艺作物中，番茄sldml2突变体有可能产生具有表观遗传变异的育种材料，从而导致抑制番茄果实成熟等多种性状，因此，利用CRISPR技术选择源自DNA甲基化/去甲基化突变体的等位基因或产生等位基因作为编辑位点进行基因编辑，获得突变系，可能成为植物育种的重要方法［70］。可以应用CRISPR/Cas9基因编辑技术在不同物种中检测ROS1在不同生物学过程中的作用，进一步了解ROS1的功能机制及在育种方面的作用。