曾佳艳 邓嘉慧 陈美娟 黄璐芳 吴学妍

在食品安全国家标准GB4789- 2016[1]大肠菌群MPN计数法和致泻大肠埃希氏菌检测时，所用培养基乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）等这些需要用小倒管（杜氏管）考察產气的培养基，经过灭菌后，会有小气泡未排空而留在小倒管内的现象发生，导致培养基不能使用。考虑到重复灭菌会破坏培养基的有效成分，对于残留气泡的此类培养基只能废弃，这样的浪费直接造成了检测成本的增加，同时也增加了检测人员的工作量。此外大肠菌群MPN计数法大多数都是多管发酵法，用的培养基量大，分装的培养基管数较多，灭菌后小倒管里的气泡排不尽，不能实现完全灭菌[2]，会影响检测结果的准确性。高压蒸汽灭菌是常用的重要灭菌法，使用该法进行灭菌时需要排出灭菌器中的冷空气，然后维持一定压力达预定时间，才能保证灭菌成功[3]。在灭菌过程中，最大限度地排除冷空气，才能更好地保证灭菌效果。本文从排气方面因素结合其他影响LST培养基灭菌后内置小倒管的气泡残留率的因素作出分析，找出安全有效的方法降低内置小倒管的气泡残留率，达到节约检测成本、减少人员工作量、保证结果准确性的目的。

1. 仪器与试剂

1.1 仪器与材料

LX-B75L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；BT-300EA蠕动泵（重庆杰恒蠕动泵有限公司）。

1.2 试药与试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）（北京三药生物科技公司）；实验用水（二级水）。

1.3 培养基配制和灭菌

取本品35.6g，加1L蒸馏水，加热溶解，分装于有倒管的试管中，每管10ml，双料称样量加倍。121℃高压灭菌15min。

2. 结果与讨论

2.1 灭菌锅的影响

为了考察不同灭菌锅的性能是否对结果有影响，通过对两个相同型号的1号锅和2号锅进行实验数据对比，结果发现两者之间并没有很大的差异，说明同型号的不同灭菌锅的性能相对稳定，对结果无影响。

2.2 倒管口径大小的影响

在分装培养基时，尽量避免内置的小倒管内有气泡。在加热加压的灭菌过程中，液体培养基沸腾会带动内置小倒管浮动。在同一立式压力蒸汽灭菌锅中，分装培养基放入同数量的小倒管（管口直径5.82mm）和大倒管（管口直径6.80mm）进行灭菌，结果发现两者之间无明显差异。

2.3 排气压力的影响

本实验的灭菌条件为：121℃高压灭菌15min，灭菌过程当锅内温度到达100℃时有冷空气排出，关闭放气阀，升温、升压至0.05MPa，人工排气10min，重复两次，升温升压灭菌。在其它条件不变的情况下，考察分别在0.03MPa、0.05MPa和0.08MPa压力排气对小倒管的气泡残留率的影响（见图1），结果显示：随着排气压力的增加，小倒管的气泡残留率明显降低。

2.4 排气时间的影响

在人工排气压力为0.05MPa，排气次数2次的条件下，考察不同的排气时间5min、10min、15min对小倒管的气泡残留率的影响（见图2），因排气时间20min过长，会导致灭菌锅水位不够而停止灭菌，故不考虑。结果显示：随着排气时间的增加，小倒管的气泡残留率明显降低，15min较10min降低了超过了50%。故在此条件下，选择排气时间15min，可获得比较满意的结果。

2.5 排气次数的影响

在人工排气压力为0.05MPa，排气时间10min的条件下，考察不同的排气次数1次、2次对小倒管的气泡残留率的影响（见图3），由于排气3次会导致灭菌锅水位不够而停止灭菌，故不考虑。结果显示：随着排气次数的增加，小倒管的气泡残留率也相应降低。

2.6 灭菌条件优化

通过对以上五个方面因素的探讨和分析，发现排气的压力、时间和次数对降低LST培养基灭菌后内置小倒管的气泡残留率有显著的影响，因此对灭菌条件进行优化。考察分别在排气压力0.03MPa、0.05MPa和0.08MPa，人工排气15min，排气2次的灭菌条件下，对小倒管的气泡残留率的影响（见表1）。结果表明，三个排气压力之间无明显差异。在确定了人工排气15min，排气2次的条件下，排气压力的选择对于降低小倒管的气泡残留率的作用较小。考虑到灭菌锅的压力与安全问题，最终选择排气压力0.03MPa，人工排气15min，排气2次的灭菌排气方案。

采用以上确认的灭菌排气方案，进行了20天的实验（见图1），结果显示：LST培养基灭菌后内置小倒管的气泡残留率控制在10%以内，已达到预期值。

3. 结论

本文从同型号不同灭菌锅的性能、倒管口径大小、排气压力、排气时间和排气次数等因素考虑，通过比对实验结果，在单因素变化的条件下，找出排气压力、排气时间和排气次数为关键影响因素，然后优化灭菌条件，考虑到灭菌锅的压力与安全问题，最终选择排气压力0.03MPa，人工排气15min，排气2次的灭菌排气方案。

由于不同品牌不同型号的灭菌锅性能不同，本文的实验数据和优化方法只限于L立式高压灭菌锅。由于考虑到每种培养基的配方不一样，本文的优化方法也只限于LST培养基，对于其它培养基的灭菌仅供参考。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB4789.1～40-2016食品安全国家标准食品微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2016.

[2]黄启红、李光宏等。浅谈影响内置小倒管培养基灭菌的因素[R] .现代检验医学杂志.2012 （2）：36-37.

[3]唐欣昀、张明、赵海泉等.高压蒸汽灭菌器中温度和压力的关系[Q] .微生物学通报.2003（3）：14.

作者简介

曾佳艳，中级职称，主要研究方向为食品药品微生物检测及其方法研究