赵艺蔓 徐香梅 徐 旭 侯恩存

广西中医药大学附属瑞康医院肝病科 (广西 南宁，530000)

茵陈蒿汤首见于汉代张仲景所著的《伤寒论》,阳明病篇第236条载“阳明病,发热,汗出,此为热越,不能发黄也。但头汗出,身无汗,剂颈而还,小便不利,渴饮水浆者,此为瘀热在里,身必发黄,茵陈蒿汤主之”[1]。原发性肝癌是由肝细胞或肝内单管上皮细胞发生的恶性肿瘤，是目前我国最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁我国人民的生命和健康[2]，有研究表明西药联合茵陈篙汤在治疗原发性肝癌黄疸方面临床效果显著[3]。但是由于中药成分的复杂性和人类基因的多样性，茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的药理学机制尚未明确。当前网络药理学已经应用于中药药性理论研究的各个方面,为从生物分子网络的结构与功能来认知中药药性提供了方法学契机和有力工具[4]。本文利用网络药理学方法探讨茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的作用机制，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 茵陈蒿汤成分的收集与筛选 茵陈蒿汤由茵陈、大黄、栀子3味中药组成。利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、DrugBank数据库收集以上3味中药的成分，将收集到的中药化学成分以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为限定条件进行筛选[5]，以增加结果可信度。

1.2 茵陈蒿汤潜在靶点的预测 将寻找到的候选化合物通过TCMSP平台及DrugBank数据库完成化学成分靶点的预测，从而得到有效成分作用的相关蛋白靶点，进行潜在治疗靶点的预测。

1.3 原发性肝癌相关靶点获取 以原发性肝癌作为关键词，检查GeneCards数据库、CTD数据库获取原发性肝癌相关靶点蛋白，根据Relevance score筛选相关度前200的靶点，获取与原发性肝癌相关的靶点。

1.4 茵陈蒿汤作用于原发性肝癌的靶点 先使用STRING平台对药物成分的主要潜在作用靶点进行靶点-基因名转换，然后通过DrawVennDiagram2.1.0平台制作韦恩图，获得茵陈蒿汤的作用靶点和原发性肝癌相关靶点，相互交集的靶点蛋白，即茵陈蒿汤作用于原发性肝癌的靶点。

1.5 成分-靶点网络构建与分析 利用Cytoscape3.6.0软件对茵陈蒿汤的成分-靶点的相互作用绘制网络图。在网络中，分别用节点(node)和边(edge)表示成分、靶点以及成分与靶点之间的相互作用。网络节点度和介数中心度越高，说明所对应化合物或靶点在网络中越重要。

1.6 茵陈蒿汤与原发性肝癌相关靶点蛋白相互作用网络构建

为了了解中药方成分及其相应目标在系统层面上的复杂相互作用，探讨茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的作用机制，通过韦恩图，获得茵陈蒿汤与原发性肝癌相互交集的靶点蛋白，通过STRING数据库制作茵陈蒿汤与原发性肝癌相关靶点蛋白相互作用PPI网络图进行分析，并利用Cytoscape3.6.0软件将网络图可视化，构建出茵陈蒿汤与原发性肝癌相关耙点蛋白的相互作用网络图。

1.7 茵陈蒿汤治疗原发性肝癌预测靶标富集分析 本研究对以上1.4获取的相关交集靶点蛋白，通过DAVID在线分析工具进行基因富集分析(GO分析)，选择生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)3个模块绘制条形图。通过DAVID在线分析工具查找富集出来的生物通路图，并利用Omicshare云平台将得到的KEGG生物途径结果进行可视化制成气泡图。

1.8 活性成分-靶蛋白分子对接 上述茵陈蒿汤所含化学成分的靶点预测结果，在蛋白综合数据库(PDB)得到相应的蛋白综合数据库编号(PDB-ID)。再把PDB-ID导入Systems Dock WebSite软件对活性成分和靶蛋白进行分子对接。输入拓扑学参数后筛选茵陈蒿汤化合物的结构，成功后开始对接，整理对接结果中分子对接评分并分析。

2 结果

2.1 茵陈蒿汤化学成分的搜集 本研究从茵陈蒿汤的各味中药成分中筛选了44种OB≥30%、DL≥0.18的潜在成分，另外还有少量药物相似指数不详的成分具有广泛的药理活性，也被纳入其中用于进一步靶点预测。茵陈、栀子、大黄分别筛选到14、15、15种成分，并且筛选出这些药物之间非重复的41种成分。见表1。

表1 茵陈蒿汤化合物具体信息

2.2 茵陈蒿汤化学成分相应靶点蛋白预测 通过TCMSP平台、DrugBank剔除重复及非人源靶点后共得出茵陈蒿汤潜在影响的靶点蛋白共计186个，将选取的41个成分以及所对应的靶点蛋白为节点，建立相互关系，导入Cytoscape3.6.0软件制作出茵陈蒿汤“化合物-靶点”网络图。在网络图中有268个节点和534条相互关系(彩插页图1)。

2.3 茵陈蒿汤与原发性肝癌相关靶点蛋白互作网络图 通过制作韦恩图获得186个茵陈蒿汤化学成分相关靶点和200个原发性肝癌相关靶点蛋白相互交集的44个靶点蛋白，以此为节点建立茵陈蒿汤成分靶点与原发性肝癌相关靶点相互作用网络图(彩插页图2)，网络图中有44个节点和455条相互关系，相互作用的关键节点有肿瘤蛋白(TP53)、负性调节转录因子(JUN)、表皮生长因子受体(EGFR)、转录激活因子(MYC)、雌激素受体(ESR1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK1)等，其中度值最高的是TP53。

2.4 茵陈蒿汤治疗原发性肝癌靶点的GO富集分析 为了进一步探讨茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的186个候选靶点的可能机制，使用DAVID对茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的候选靶点进行GO富集分析和KEGG生物途径分析，经过统计学分析后分别将BP、MF和CC中排名靠前的条目绘制成条形图(彩插页图3)。

2.5 茵陈蒿汤治疗原发性肝癌靶点的KEGG生物途径分析 通过KEGG分析茵陈蒿汤显著发挥影响的20个生物途径(彩插页图4)，结果显示，茵陈蒿汤治疗原发性肝癌的机制主要涉及PI3K-Akt、MAPK信号通路、Hepatitis B信号通路、HTLV-I信号通路、Tuberculosis信号通路等。

2.6 茵陈蒿汤化合物和疾病靶点对接验证结果 将茵陈蒿汤化合物和疾病靶点进行简单的对接验证，发现Mol358(β-谷甾醇)、MOL98(槲皮黄酮)、MOL354(异鼠李素)、MOL422(山柰酚)、MOL471(芦荟大黄素)为结合力最强的分子。分子对接结果见表2。茵陈蒿汤多个靶点分子对接评分>8.0，有强烈的结合活性(彩插页图5)。

表2 茵陈蒿汤化合物和疾病靶点分子对接结果

3 讨论

茵陈蒿汤由茵陈、栀子、大黄等药材组成，方中茵陈清热利湿;栀子通利三焦,导热下行,引湿热自小便出;大黄泻热逐瘀退黄,通利大便。共奏利尿通便、祛湿退热之功效。有研究表明茵陈的槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素等有效成分使茵陈具有抗肿瘤、镇痛抗炎、调节免疫的功效，并具有保肝利胆、调节心血管系统等药用价值[6]。大黄的蒽醌类主要的有效成分大黄酸和大黄素在许多研究中已发现此二者重多条信号通路，如MAPK信号通路和(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)PI3 K/Akt信号通路，对肿瘤的生长、增殖、凋亡和转移均具有一定的药物作用[6]。栀子具有抗炎、解热、镇痛、保肝、利胆、降血脂、抗血栓、神经保护等作用[7]。本研究基于网络药理学手段,对茵陈蒿汤进行成分、靶点与疾病的生物信息学综合网络构建，探究了该方治疗原发性肝癌的整体机制，呈现出中医中药治疗的多成分、多靶点、整合调节的特点，并进一步通过网络分析揭示出核心作用通路。

在化合物靶点网络中部分关键化合物分子具有高度的中心性的儿茶素，体外实验中儿茶素本身也可以引起多种肿瘤细胞株凋亡，具有保肝利胆、抗肿瘤等作用[3]。儿茶素由3个烃环组成，从结构上可分为非酯型儿茶素和酯型儿茶素两大类。有研究表明其中2种酯型儿茶素——表没食子儿茶素、没食子酸酯可能是抗肝癌效果较好的儿茶素单体[8]，并有研究证实了没食子酸酯对肝癌细胞具有抑制增殖、诱导凋亡及周期阻滞的作用效果[9]。

本文利用Cytoscape3.6.0软件对网络图进行分析后，发现相互作用的关键节点有TP53、JUN、EGFR、MYC、ESR1、MAPK1等，其中度值最高的是TP53。一般认为TP53基因是人类肿瘤中最常发生变化的基因,它位于染色体17 p13.1，编码53 kDa的核磷酸蛋白,此蛋白通过p21蛋白参与细胞周期的调控,阻止细胞G1期进入S期,对细胞分裂和增殖起负调节作用。若TP53基因突变,则最终使细胞生长和分化的调节失控,导致细胞持续分裂和癌变[10]。TP53突变与人体原发性肝癌密切相关。一些实验证明[11],在不同的生理条件下,TP53在启动细胞凋亡时起作用。特殊信号转导通道的生理信号或活动能阻止TP53介导的凋亡。当TP53过度表达或被激活时,细胞将走向凋亡。据国内外相关研究，在肿瘤的发生发展过程中,TP53 INP2既可发挥抑制肿瘤也可发挥促进肿瘤的功能。TP53 INP2在不同肿瘤发生发展过程的差异性表达及其不同的亚细胞定位,可能与其在对应肿瘤细胞系中发挥不同的功能有关[12]。

在KEGG生物途径富集分析中，PI3 K-Akt、MAPK信号通路、HTLV-I信号通路、Hepatitis B信号通路、Tuberculosis信号通路等被显著性富集。PI3 K-AKT信号通路在肝癌细胞生长、分化、增殖、迁移和存活中扮演重要角色，与肝癌发生发展密切相关[13，14]。PI3 K是一种脂类激酶，活化的PI3 K可将磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)。PI3 K信号通路的持续激活与细胞的增殖、凋亡等过程密切相关,会导致细胞异常增殖和恶性转化[15，16]。PIP3可使其主要下游底物AKT准确定位到近膜区并发生构象变化，同时活化的AKT转位到细胞质和细胞核内，作用于下游底物，调控细胞代谢、蛋白合成、细胞增殖与凋亡等重要生理过程，参与细胞生长、增殖及分化调节。PI3 K-AKT信号通路是一条广泛存在于细胞中的信号转导通路，在细胞增殖调控中起重要作用，其表达异常存在于多种癌细胞中，尤其与肝癌发病关系密切[17]。MAPKs是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它们在细胞的增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用[18]。P38 MAPK也称为RK或CSBP,它是酵母HOG激酶的哺乳动物同源基因,作为MAPKs家族中重要的组成部分,与肿瘤的发生、发展和转移等密切相关,它主要通过调控下游多种酶及转录因子的基因表达活性发挥生物细胞学效应[19]。在茵陈蒿汤治疗原发性肝癌黄疸方面这两条信号通路，相互影响，相互促进。

本研究利用网络药理学的方法研究茵陈蒿汤治疗原发性肝癌，其作用机制可能与PI3 K-Akt、MAPK信号通路等信号通路有关。尽管有一些新的发现，但这项研究还有一些局限性，比如由于数据库中信息不完全，茵陈蒿汤中的一些化合物可能会被忽略，一些活性成分在筛选过程中可能会被遗漏；仅选取前200个原发性肝癌靶点不够全面，可能遗漏其他与药物联系紧密的重要靶点；片面考虑了直接作用而非间接作用等，在今后的研究中，需要进一步研究，并加以实验验证。