郑文寅，陈心婷，刘家欣，钱伟豪，姜 淼，廖 涵，张 持

(安徽农业大学 农学院，安徽 合肥 230036)

单宁又称单宁酸，鞣酸，是具有涩味的复杂的多元酚类化合物，在很多蔬果谷物中都存在[1]。单宁具有多重作用，如抗氧化、沉淀蛋白质、植物防御和营养健康等，而受到营养学家、生理学家、育种学家的关注[2]。在高粱、油菜等种子中，单宁含量较高，不仅可以影响种子的透性，还具有杀菌作用，单宁含量高的种子不仅能够抗穗发芽，还能减少种子的发霉[3]。可见，单宁和种子的生理及品质有着密切的关系。

植物单宁的测定方法有很多[4-5]，如蛋白质沉淀法、高效液相色谱法、Folin酚还原法、正丁醇盐酸法和香草醛法等[6-8]。Folin酚还原法适合测定植物的总酚含量，但其他一些容易被氧化的物质如抗坏血酸或非单宁酚的存在会使测定结果偏高。正丁醇盐酸法和香草醛法都适用于缩合单宁的测定，尤其香草醛法可以测定缩合单宁的前体如儿茶素等黄烷醇类物质[9]，同时不与黄酮反应，尤其适合测定含有黄酮类物质的样品。

影响植物单宁测定的因素有很多。对于丙酮浓度的影响，李学强等[10]认为提取欧李肉中单宁的最佳提取条件中丙酮的浓度为60%，而张立华等[11]研究超声波辅助提取石榴叶中单宁时也认为丙酮溶液对单宁的溶解能力最强，宜选用丙酮作为提取剂。不同的料液比也会影响单宁提取效果，料液比1∶10～1∶40(g/mL)范围内随溶剂用量的加大，单宁提取率也随之提高。提取时间的长短直接决定了样品中的单宁能否被提取彻底，由侯万伟等[12]对蚕豆种皮中单宁提取工艺优化的研究，他们在冷浸材料3、5、7、9、11 h测定单宁含量，结果表明当到达7 h时，单宁提取量最大，9 h相对7 h稍有降低。范璐等[13]探讨了高速离心与双层中速滤纸过滤法的差异对高粱中单宁含量的影响，结果表明两种方法的测定结果并无明显差异，考虑到试验效率，选用高速离心法分离提取液， 离心时间的长短影响到上清液中小麦粉的残留，时间太短则残留过多，显色结果影响就较大。蒸馏过程中的一些因素也会影响单宁提取量，如蒸馏瓶中上清液能否蒸干，即蒸馏时间的长短等，可能会影响显色结果。此外，显色温度的确定对于准确测定单宁具有重要影响，刘琴等[9]人的研究认为，当反应温度为20 ℃或25 ℃时，吸光度接近，当反应温度升高至30 ℃后，体系的吸光值呈明显下降趋势。

迄今为止，尚未见有效测定小麦籽粒单宁含量的相关报道。因此，本试验主要研究小麦中的缩合单宁，选用香草醛法，在单因素预试验的基础上，应用正交试验进行小麦单宁含量测定方法的进一步优化，并用56份来源广泛的小麦种质资源进行验证这一方法的精确度，以期获得一种经济高效的小麦籽粒单宁的测定方法，为研究其生理和品质效应提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

正交试验和验证试验所用到的材料均来自安徽农业大学农学院种子科学试验室收集小麦种质资源。使用的主要试剂包括丙酮(分析纯，西陇化工股份有限公司)；甲醇(分析纯，上海振兴化工一厂)；儿茶素(标准品，北京索莱宝科技有限公司)；香草醛(标准品，源叶生物)；冰醋酸(生物工程(上海)股份有限公司)；浓硫酸(分析纯，西陇化工股份有限公司)。主要仪器设备包括AX324ZH电子分析天平；BECKMAN-Allegra离心机；RE-52AA旋转蒸馏仪；JK-3200B超声波清洗仪；TU-1810紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 对各小麦品种去除空瘪粒和杂质，分别选取20 g左右的种子用高速万能粉碎机约粉碎1 min，然后放塑封袋于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 标准曲线制作 参考刘琴等[9]的方法，准确称取0.002 5 g儿茶素，用甲醇溶剂将其配制成浓度为500 μg/mL的母液，并将其稀释得40、80、120、160、200 μg/mL的梯度溶液备用；然后称取1.000 0 g香草醛溶于100 mL冰醋酸配制成1%香草醛-冰醋酸溶液、量取35 mL浓硫酸与65 mL冰醋酸混合配置成35%浓硫酸-冰醋酸溶液，用前将两份溶液混合即为工作液，工作液现用现配。取各梯度标准溶液0.2 mL，设置0.2 mL甲醇为空白，然后分别加6 mL工作液摇匀静置20 min，用甲醇处理组作参照，于510 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。

1.2.3 正交试验 综合文献及预试验，选取小麦料液比、浸提时间、离心时间等7因素(各因素间无明显交互作用)3水平进行L18(37)正交试验，试验设计如表1。

表1 小麦籽粒单宁提取因素水平表

1.2.4 小麦籽粒单宁含量的测定 按表1将1.2.1中制备的样品称取一定量于50 mL离心管中，加入一定量的丙酮，室温浸提一定时间，用离心机中离心(4 000 r/min)一定时间，取上清液于蒸馏瓶中，用真空旋转蒸馏仪蒸干(45 ℃)。在蒸干的蒸馏瓶内加入一定量的甲醇溶液，保鲜膜封口，在超声波清洗机中清洗一定时间，吸取烧瓶中的溶液即为单宁提取液(待测液)。

分别吸取待测液和标液各0.2 mL，并加入6 mL的工作液中，摇匀，在一定的温度下显色一定时间，测定其在510 nm处的吸光值，记录数据。单宁含量计算公式为：

W=0.001cV/m

式中：W为单宁含量(mg/g)；c为从标准曲线中查得单宁的浓度(μg/mL)；V为甲醇体积(mL)；m为称取的小麦样品的质量(g)。

1.2.5 重复性验证试验 选取了56份材料用确定好的试验条件进行单宁的提取，对比各品种间和重复间单宁含量的差异性，获得RSD值，以验证本试验方法的精确度。

1.2.6 数据分析 利用excel对数据统计整理，利用SPSS 6.0对数据进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析2.1 正交试验结果与方差分析

根据正交试验结果，计算出每个因素同一水平下的试验值之和Ki及每一因素同水平下的数据平均值ki，并根据Ki 和ki计算出同一因素不同水平间平均值的极差R。R值反映了影响因素对反应体系的影响，R越大，影响越显著，反之，影响越不显著。由表2中极差结果可以看出，各因素对小麦籽粒中单宁含量测定结果的影响顺序为C(离心时间)>F(清洗时间)>A(料液比)>E(甲醇体积)>G(显色温度)>D(蒸馏时间)> B(浸提时间),即离心时间的长短对单宁提取量影响最大，而浸提时间影响最小。从表2中可以看出小麦籽粒单宁提取的最佳条件为A1、B1、C1、D1、E3、F3、G2，即以料液比为1∶10，室温浸提12 h，离心10 min，蒸馏8 min。2.5 mL甲醇溶解，超声波清洗8 min，并在20 ℃下显色测定单宁含量。

为了确定不同因素的显著性影响，同时对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。由表3可知，重复间差异不显著，而A、C、E、F、G各因素水平对单宁含量有显著影响，B、D两因素各水平对试验结果无显著影响，即浸提时间与蒸馏时间对试验结果无显著影响，与表3的极差分析结果基本一致。

综上分析，为省时高效，在后面的验证时间中，选择较短浸提时间6 h来测定小麦籽粒单宁的提取，即本试验中优化的方法为:料液比为1∶10，浸提时间为6 h，离心时间为10 min，蒸馏时间为8 min，甲醇体积为2.5 mL，清洗时间为8 min，显色温度为20 ℃。

表2 正交试验设计L18(37)及结果

表3 正交试验方差分析

2.2 重复性验证试验

从表4可见，该测定方法的精确度为0.25%～5.00%，RSD均不小5%，达到了分析精度要求，因此这一优化方法是有效的。

为了进一步地给小麦籽粒中单宁含量遗传分析提供理论基础，对56份材料进行了方差分析。由表5可知，品种间的F=19.078，P<0.01，表明用该方法提取不同品种小麦籽粒单宁含量具有极显著差异，也说明不同小麦籽粒单宁含量间有极显著差异，即该方法能有效测定和区分不同品种小麦籽粒的单宁含量。

表4 验证试验结果

表5 56份材料的方差分析

3 结论与讨论

测定小麦籽粒单宁含量的方法，国内暂无相关报道，国外相关研究也很少。不同植物间单宁含量测定方法存在差异，也间接说明了探究一种适合小麦单宁含量测定的方法的必要性。本试验借鉴上述参考文献中其他植物单宁的提取方法，确定了七因素三水平的正交试验以进行优化。结果中，料液比1∶10与冯爱青等[14]等人以银杏叶为试验材料提取单宁的方法结果一致，但与张立华等[11]提取石榴叶中的单宁，顾海峰等[15]提取柿子中的单宁，任平等[16]提取石榴皮中的单宁，钟雨坤等[17]提取桑叶中单宁，李学强等[10]提取欧李果肉中的单宁的结果不完全一致，可能是由于试验材料及试验方法的不同造成的，其他条件如浸提时间，浸提，显色温度的不同也与料液比的原因类似。显色温度对测定单宁的影响并不显著，即在20、25和30 ℃这3个温度下的显色结果无显著差异。此外，离心时间，清洗时间，甲醇体积等因素在其他植物单宁提取中并未涉及，而我们在单因素试验过程中发现它们可能会影响测定结果的因素。正交试验结果表明，以上3因素对试验结果有极显著影响，充分考虑这3个因素，可以提高该测定方法的有效性和准确性。

本研究中，由56个不同基因型小麦品种的籽粒单宁含量的方差分析结果可知小麦品种间存在着极显著差异，说明不同品种类型小麦籽粒里的单宁含量也有所不同，这表明小麦籽粒里的单宁含量受品种类型的影响。本研究可为小麦品种选育奠定基础，通过采取不同的育种方法培育所需高低单宁含量的小麦品种，进而为小麦种子单宁的生理和品质效应提供种质资源材料。另一方面可通过杂交、回交等常规育种方法培育较高单宁含量的小麦品种，以内源单宁替代外源添加剂的使用，同时有效提高小麦的烘培品质。

综上所述，本试验通过正交试验，确定了香草醛法测定小麦籽粒单宁含量的优化方法为：料液比为1∶10，浸提时间为6 h，离心时间为10 min，蒸馏时间为8 min，甲醇体积为2.5 mL，清洗时间为8 min，显色温度为20 ℃。并用此方法测定了56份材料，精密度RSD均小于5%，且不同小麦品种间单宁含量具有极显著差异，因此，该方法是一种经济、有效、准确的方法，并且可以区分不同小麦品种间单宁含量的差异。