周晓艳，李 越，何 谦，袁晓红，张海宝

（1. 西安交通大学第二附属医院检验科，西安 710004； 2.西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，西安 710061）

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB)，是一种高度保守的蛋白质，因具有增殖抑制作用而得名，分PHB1 和PHB2 两个亚型[1]。在自然界中分布广泛，参与人类肿瘤的增殖、转录、分化、凋亡及能量代谢等过程，与细胞衰老、免疫调节、代谢性及炎症性疾病亦紧密联系。在细胞内作为重要的分子伴侣参与线粒体结构和功能的完整性[2]。近年来乳腺癌发病率及死亡率逐年升高，而 PHB 在乳腺癌组织中表达升高[3]，提示可能成为乳腺癌早期筛查新的生物标志物，可作为乳腺癌诊疗的重要靶点[4,5]。本课题组在前期蛋白质组学的研究中发现，核基质蛋白PHB 在正常乳腺组织、乳腺增生性病变组织、不典型上皮增生组织和乳腺癌组织4 个乳腺癌不同阶段表达逐渐升高[6]，并鉴定了PHB 干扰在乳腺癌MCF-7 中低表达的效果[7]。此次研究验证了PHB 的高表达，以及PHB 在乳腺癌细胞MCF-7 的生物学功能及生长抑制机制，为乳腺癌的临床诊断、治疗和药物研发提供新靶标和新的研究线索。

1 材料与试剂

1.1 细胞株来源 人乳腺癌MCF-7 细胞保留了多个分化了的乳腺上皮特性，该研究中MCF-7 受赠与西安交通大学第一附属医院妇产科实验室。

1.2 主要试剂 胎牛血清和DMEM 高糖培养基购于HyClone 公 司，LipofectamineTM2000 为Invitrogen 公司产品，扩增试剂为青岛Takara 公司产品，Anti-prohibitin 抗体（ab47778）和兔抗人β-actin（ab6276）均为英国Abcam 公司购买，周期及凋亡试剂盒购于武汉凯基生物有限公司，BALB/C 裸鼠来自西安交通大学实验动物中心 。

1.3 实验方法

1.3.1 pEGFP-PHB 基因表达质粒构建：在NCBI 中查阅PHB 的基因序列，以NM_002634 为模板，根据全基因序列，设计29 条引物依次进行扩增，使其序列不断延长，直至完成所需序列。扩增后电泳，回收837kb 左右条带进行基因测序。使用Bgl Ⅱ/BamH I 内切酶回收所需的载体骨架pEGFP-C1。将PCR 扩增得到的全长基因和载体在同源重组酶下重组。选用标准大肠菌株ATCC 25922 为转化菌株，转化并挑取单克隆进行基因测序。

1.3.2 细胞培养及真核细胞转染：用质量分数为10ml/dl 胎牛血清的DMEM（高糖）培养液于37℃，体积分数为5ml/dl CO2细胞培养箱培养，2天换液一次，3 天传代一次。转染时DNA 与转染试剂Lipofectamine2000 最佳比例为1∶3。转染重组质粒pEGFP-PHB 组为PHB 高表达组，即OE 组（转染重组质粒pEGFP-PHB），转染空质粒组为阴性对照组，即NC 组（转染载体pEGFP），只添加Lipofectamine2000 转染试剂定位空白对照组，即MOCK 组（只添加转染试剂）。转染于6, 12, 24, 48 和72h 细胞的生长状态及荧光表达情况。

1.3.3 real Time PCR 检测PHB 基因表达：使用Trizol试剂提取总RNA，每组细胞重复3 次，分别提取总RNA，使用Nanodrop2000 核酸蛋白分析仪检测RNA浓度并做RNA 变性实验。使用Primer 3.0 软件设计引物（PHB: Primer1: 5'-GGCTGAGCAACAGAAAAAGG-3'， Primer2: 3'-TTGTAGTGGATGGACGGTCG -5'; GAPDH：Primer1:5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3', Primer2: 3' -AGGTGACCGCAGAAGTGGT-5'。），按照 Takara 公司基因扩增说明书进行real-time PCR 反应。扩增条件：95℃反应5s，55℃反应30s，总共40 个循环。以Ct值表示实时定量PCR 扩增的结果，即基因扩增产物的荧光值达到设定阈值所经过的循环数。计算出每组△Ct（CtTarget-CtGAPDH）。Folds=2-△△Ct，其中△△Ct=(Ctl处理样品待测基因-(Ct1处理样品待测基因-Ct2处理样品内参基因)-(Ct3对照样品侍测基因-Ct4对照样品内参基因)， 2-△△Ct即为实验组基因mRNA 相对于对照组的表达倍数。

1.3.4 Western Blotting 检测PHB 蛋白的表达：使用RIPA 细胞裂解液100μl 裂解细胞，按照SDSPAGE 试剂盒说明书配置分离胶和浓缩胶，每组设置两个复孔，上层浓缩胶80V 跑30min，下层分离胶120V 跑1h。用PVDF 转膜，并于质量分数为5ml/dl 的牛奶封闭液中封闭2h，依次孵育一抗(1∶5 000稀释，4℃过夜)和相应二抗（1∶1 000稀释）。在UVP 凝胶成像系统进行显色，Quantity one 软件计算灰度值。

1.3.5 MTT 生长曲线测定：设PHB 高表达组、阴性对照组及空白对照3 组，每组3 个复孔。转染4h后更换成完全培养液，分别于转染后24, 48 和72 h，每孔加入MTT 液20μl，继续孵育4 h 后终止培养，弃去孔内上清液，再加入100 μl DMSO，震荡 5～10min。以空白培养液组调零，在酶标仪上测490 nm 波长处各孔的光密度值。细胞生长抑制率的计算公式如下：细胞生长抑制率=1-实验组A490nm值/对照组A490nm值。

1.3.6 Transwell 小室侵袭能力检测：转染48h 时收集细胞，调整细胞悬液浓度到2.5×105个/ml，取200 μl 细胞悬液加入已铺好的Martrigel（1∶8 稀释）小室中继续培养16 h。用95ml/dl 乙醇/甲醛和100ml/dl 甲醇依次处理后，用0.1g/dl 结晶紫染液染20 min， PBS 洗两次后用棉签擦拭小室内细胞，将小室倒置于显微镜下，随机计数10 个视野中的细胞数。

1.3.7 流式细胞仪测周期和凋亡变化：MCF-7 细胞同步化后分别转染重组质粒和空质粒，并设空白对照组，按照细胞周期试剂盒和凋亡试剂盒处理各组细胞，用Becton Dickinson 流式细胞仪检测DNA-PI的荧光强度，发射光和激发光的波长分别是530nm和488nm；Cell Quest V.4.0 进行数据采集，Mod Fit LT 软件系统分析细胞周期和G1, S, G2 期细胞比例，以及细胞凋亡在各种中的比例并进行数据统计。

1.3.8 肿瘤相关蛋白测定：按照SDS-PAGE 试剂盒说明检测三组中PHB 高表达情况和肿瘤相关蛋白P53, Bcl-2, E2F-1 和ERBB2 的表达量，同样，在UVP 中进行显色，用Quantity one 软件计算灰度值，进行数据处理。

1.4 统计学分析 计量资料采用Shapiro-Wilk 法检验数据的正态分布，所有数据均以均数±标准差（+s）表示，运用SPSS19.0 软件处理数据，并用GraphPad Prime 5.0 作图。两独立样本间差异比较采用t检验，多个样本组间差异比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两多重比较采用LSD-t检验。检验水准为α=0.05（双侧）。

2 结果

2.1 重组质粒构建及细胞转染 PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳条带大小处于750～1 000kb 之间，见图 1A 所示，回收纯化后进行DNA 测序，测序结果与NCBI 中一致。重组质粒 pEGFP-PHB 双酶切后目的条带位于837kb 左右，符合PHB 基因分子量大小，见图1B。乳腺癌细胞系MCF-7呈多边形，贴壁生长。转染24h 后观察载体荧光蛋白表达量，转染效率可达75%以上，见图1D。

2.2 Real time-PCR 及WesternBlot 检测PHB 高表达 质粒转染后OE 组，NC 组和MOCK 组提取总RNA 浓度分别为719, 552 和1 004.5ng/μl，A260nm/A280nm比值分别为1.97, 2.0 和1.99，RNA 琼脂糖凝胶电泳可见28S, 18S 和5S 条带，见图2A。Real time-PCR 后各组PHB 的表达量见图2B，OE组PHB 表达量明显高于NC 组和MOCK 组，差异有统计学意义（F=790.5,P＜0.0001）。Western Blotting 结果显示，OE 组PHB 蛋白表达明显高于NC 组和MOCK 组，见图2C，差异有统计学意义（F=6.206,P=0.034）。

图2 Real time PCR 及Western blot 检测PHB 高表达

2.3 MTT 检测细胞生长 质粒转染24, 48 和72h后的细胞生长曲线见图3，PHB 高表达组细胞吸光度值均低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义（F=12.74,P=0.034;F=118.5,P＜0.001;F=19.22,P=0.002;）。PHB 在三个时间点的细胞生长抑制率分别为20.98%, 14.93%和62.94%，即PHB 过表达后，细胞生长受到抑制，细胞存活率降低。

图3 MTT 法细胞生长曲线测定

2.4 Transwell 小室侵袭能力检测 侵袭细胞固定染色后随机计数10 个视野， OE 组细胞数为54.5±7.4 个，NC 组细胞数为66.0±12.6 个，MOCK 组细胞数为64.0±5.6 个，OE 组侵袭细胞数低于对照组，差异有统计学意义（t=3.221,P=0.012;t=4.057,P=0.003），对照组间差异无统计学意义（t=0.334,P=0.746）。

2.5 细胞周期和凋亡检测 转染后的细胞固定并用PI 染色，流式细胞仪检测细胞周期。OE 组，NC组和MOCK组的G1期分别为（49.26±6.39）%, （51.36±4.78）% 和（54.41±2.37）%， 三组G1期比例差异无统计学意义（F=0.241,P=0.799）。S 期分别为（14.30±6.97）%，（27.07±4.44）%和（26.54±0.87）%，差异有统计学意义（F=4.872，P=0.039）。G2期分别为（34.76±3.51）%，（21.57±2.32）%和（19.04±2.83）%，差异有统计学意义（F=12.74,P=0.0342）。

转染后收集细胞用凋亡试剂盒染色检测各组细胞数量及凋亡比例。OE 组，NC 组和MOCK 组细胞凋亡率分别为（33.67±8.68）%，（12.13±3.76）%和（6.99±2.33）%，OE组的细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义（F=18.992,P=0.003），NC 组与MOCK 组间差异无统计学意义（t=3.350,P=0.079）。

2.6 肿瘤相关蛋白检测 SDS-PAGE 凝胶电泳结果见图4。P53 和ERBB2 蛋白表达量OE 组高于NC组，差异有统计学意义（t=4.590,P=0.44；t=9.489,P=0.011）；Bcl-2 蛋白OE组低于NC组，差异有统计学意义(t=7.143,P=0.019)；E2F-1 蛋白水平OE 组与NC 组之间差异无统计学意义(t=2.175,P=0.162)。

图4 肿瘤相关蛋白检测

3 讨论

抗增殖蛋白（Prohibitin，phb/PHB），亦称阻抑素，因具有细胞增殖抑制功能而得名，是一种高度同源保守的蛋白质，在染色体上位于17q21，长11kb。其两种亚型PHB1 和PHB2 相互缠绕形成指环样结构，维持线粒体结构稳定性和功能完整性[2,8]。PHB 蛋白功能丰富多样，参与细胞多个进程，包括增殖抑制、能量调节、转录调控、分化凋亡和免疫调控等[9]。近年来，乳腺癌已成为全球女性首位恶性肿瘤，发病率和致死率也逐年升高，在我国，其发病率明显年轻化。自1992年PHB 基因多态性与乳腺癌易感性的研究开始，越来越多的学者关注其作用机制，日本学者KIM 等[10]从乳腺癌治疗方面亦证实PHB 发挥重要作用。

本次研究结果显示，PHB 高表达后细胞存活率降低，S 期的比例降低，这与大多数研究者的结果相符，表明PHB 抑制了乳腺癌细胞MCF-7 的生长，使细胞处于低增殖的状态，这可能与S 期DNA 合成减少及G2/M 期细胞阻滞有关。S 期是细胞间期DNA 合成的重要时期，DNA 合成的不足或者缺陷将影响细胞分裂期的进行以及细胞功能完整性。有学者发现PHB 对细胞的增殖抑制主要是通过对正性调控因子E2F 家族蛋白的抑制和抑癌基因P53 的活化来实现的[10,14]，本次研究也发现PHB 高表达时，P53 表达水平增高（t=9.489,P=0.011），提示P53确实参与增殖抑制通路，而E2F-1 的表达未发生变化（t=2.175,P=0.162），不能支持 P53 作为E2F-1上游调控因子参与PHB 作用机制的观点。PHB 可能通过P53 的途径抑制细胞增殖，或是激活Ras-Raf-MEK-ERK 途径来发挥抑制细胞增殖作用[9,13]，需要进一步深入研究和验证。

除此以外，PHB 的高表达使得细胞凋亡增加，同时凋亡相关蛋白Bcl-2 水平减低，分析其原因可能是PHB 和Bcl-2 都具有稳定线粒体的功能，Bcl-2 的降低使得线粒体膜稳定性下降，线粒体外膜蛋白MOMP 和线粒体内膜蛋白如细胞色素C 的释放增加，导致能量代谢障碍而引起细胞凋亡数量和比例增加。与乳腺癌侵袭性、治疗及预后紧密相关的人类表皮生长因子ERBB2，即Her2 基因，可为Her2 阳性乳腺癌患者提供有效的治疗效果[14]，针对Her2 阳性乳腺癌已有好的靶向药物，包括曲妥珠 / 帕妥珠单抗等。在本次研究中，PHB高表达时Her2 蛋白水平增高，有望提高靶向药物治疗效果，可以增加激素和化疗药物的敏感性，同时降低乳腺癌的侵袭性，若PHB 和ERBB2 能够联合应用于Her2 阳性乳腺癌患者，将可能为乳腺癌治疗开辟新的路径。

由上述分析可知：PHB 高表达在细胞水平具有抑制细胞增殖的功能，同时使得细胞凋亡增加，整体表现出抑制乳腺癌细胞MCF-7 生长的现象。进而探索导致细胞生长抑制的分子水平变化，提示癌基因P53、正性转录因子E2F-1、凋亡相关蛋白Bcl-2 在PHB 对乳腺癌细胞的生长抑制过程中发挥重要作用。该研究为PHB 在乳腺癌细胞中的生物学功能提供了可靠资料，并对PHB 抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制进行深入细致的研究，需要进一步进行动物实验验证。