任伟绮，陈 钰，刘仲明，王 捷

（南部战区总医院基础医学实验室，广州510010）

0 引言

传染病严重威胁着人类健康。据世界卫生组织统计，平均每年有1 700 多万人死于各种传染病，约占全球死亡人数的30%[1]，主要分布于中低收入国家。实现传染病病原体的精准、快速、低成本检测对传染病的防治尤为重要。虽然目前有许多有效检测病原体的方法，如平板培养、显微镜直接观察法、基因组扩增和免疫检测等，但这些方法各有缺点，在贫瘠、条件有限的疫区并不适用。如病原体培养方法费时，通常需要数天或数周才能产生结果，而提前经验性使用抗生素可能会导致耐药菌的流行；显微镜检仅限于镜下查找病原体，存在现场检测灵敏度低的问题；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）通常依赖昂贵的仪器设备和专业操作人员。此外，在贫瘠偏远的疫区，生物样本往往被集中转运到上级医院或实验室进行检测，在数天或数周后方可收到检查结果，严重降低了偏远疫区的诊治效率。世界卫生组织针对中低收入国家在传染病床旁诊断所面临的复杂状况、多样性需求以及各种障碍，提出了即时检测（point-of-care testing，POCT）解决方案并创建了ASSURED 原则，即可支付（affordable）、特异（specific）、敏感（sensitive）、用户友好（user-friendly）、检测迅速可靠（rapid and robust）、无需设备或者设备简单（equipment free or minimal equipment）、易于携带（deliverable to end-users）。

近年来，检测病原体标志物（DNA/RNA、糖蛋白、酶、抗体等）的生物传感技术陆续出现，其通常基于纳米、微流控技术，依赖光、电、磁等检测方法，虽然产生阳性信号的机制各不相同，但都可通过优化检测条件或结合其他技术成为传染病病原体POCT的有力工具，实现病原体的快速检测。本文根据检测方法的不同，对基于光学、电化学、磁学的生物传感技术在传染病病原体POCT 中的研究进展及其应用的优缺点进行综述。

1 光学、电化学、磁学生物传感技术在传染病病原体POCT 中的研究进展

1.1 光学检测

1.1.1 荧光偏振法

荧光偏振法是一种常用的荧光分析方法，通过对探针进行荧光标记，然后探针与靶分子相互作用，从而产生偏振光。荧光偏振法与其他的荧光免疫检测方法相比，样本制备简单，已被用于流感[2]、结核分枝杆菌[3]、沙门菌[4]和布鲁氏菌[5]等病原体的检测。在免疫诊断方面，Gwida 等[6]分别应用虎红平板凝集试验（Rose-Bengal plate agglutination test，RBPT）、补体结合试验（complement fixation test，CFT）、试管凝集试验（standard tube agglutination test，SAT）、竞争性酶联免疫吸附测定（competitive enzyme linked immunosorbent assay，cELISA）和荧光偏振免疫分析方法（fluorescence poliarization immunoassy，FPIA）对来自苏丹的895 份骆驼血清进行布鲁氏菌的检测，结果显示FPIA 阳性率为79.3%，明显高于CFT（71.4%）、RBT（70.7%）、SAT（70.6%）和cELISA（68.8%）。实时定量荧光PCR 对传染病潜伏期的检测敏感度高但特异度低，而该方法同时具有很高的敏感度和特异度。在分子诊断方面，Zhang 等[2]报道了一种基于功能性量子点荧光探针及双功能蛋白结合适配体的甲型流感病毒荧光偏振检测平台，其线性范围为10～100 nmol/L，检测限为3.45 nmol/L。Park 等[4]利用荧光偏振法检测沙门氏菌，并对不同亚型的沙门氏菌（如鼠伤寒杆菌和副伤寒杆菌）进行鉴别，检出限为1 cfu/ml，检测完成时间为20 min。与传统的PCR 检测方法相比，该方法具有简便、快速、成本低、无需洗涤、受环境影响小等优点，结合微型PCR 仪和光学检测器，有望构建一个强有力的传染病病原体生物传感POCT平台。

1.1.2 表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）法

SPR 是一种光学现象，利用全反射时入射光与金属表面的等离子体发生共振的原理，实时跟踪天然状态下生物分子间的相互作用（如图1 所示）[7]。SPR技术有诸多优点，如样品用量少、检测速度快、灵敏度高[8]。SPR 与芯片技术结合，既可以充分发挥SPR高特异度、高灵敏度、不需标记及纯化、实时等特点，又可进一步结合基因芯片高通量的特点，从而快速、简单、准确地实现基因的定性和定量检测[9]。田玉峰等[10]利用SPR 型基因芯片系统成功检测出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、洛菲不动杆菌、铜绿假单胞菌、淋球菌及人类乳头瘤病毒，其检测结果与临床常规检测结果一致。该方法取代了现有芯片的标记检测技术，实现了SPR 技术的高通量检测，整个过程简便且易于自动化，为临床病原微生物的早期发现及准确诊断提供了一定的理论和实验依据，具有较好的应用前景。Taylor 等[11]利用多通道SPR 仪实现了同时对4 种食源性病原菌（大肠埃希菌O157：H7、鼠伤寒沙门菌、单核细胞增生性李斯特菌和空肠弯曲菌）的定量检测，检出限为3.4×103～1.2×105cfu/ml。Hu 等[12]通过SPR 生物分析系统对猪圆环病毒Ⅱ型进行检测，检测一个样品的时间约为20 min，检出限达到0.04 mg/ml。

图1 表面等离子共振原理图[7]

具有代表性的光学检测方法及基本情况汇总详见表1。

1.2 电化学检测

1.2.1 伏安法

伏安法是电势控制法的一种，这类方法的电极电势强制依附于已知程序，电势控制在恒定值或者按预先确定的方式随时间变化，通过记录电流与时间或电势的关系从而获得分析结果[13]。Ng 等[14]利用链霉亲和素与生物素具有高亲和力的特点，用金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）电化学法检测结核分枝杆菌，通过检测电极表面AuNPs 偶联物的差分脉冲伏安信号的变化即可定量获得靶核酸浓度（如图2 所示），最低检测浓度达1 cfu/ml，比传统的凝胶电泳灵敏度更高，可应用到便携式恒电位仪上，进一步开发为POCT 诊断工具。Miao 等[15]将微机电系统（micro-electro-mechanical system，MEMS）与适配体结合，开发了一种小型便携式电化学传感器，用于简单、灵敏、快速地检测诺如病毒，采用循环伏安法和方波伏安法（Osteryoung square-wave voltammetry，OSWV）对不同滴度病毒进行电化学测试，结果显示电流大小与病毒浓度呈线性关系，实现了诺如病毒的定量检测。这种便携式MEMS 传感器也可用于其他微生物病原体的检测，具有发展为传染病病原体生物传感POCT 平台的潜力。Grabowska 等[16]将金属碳硼烷氧化还原标记的寡核苷酸探针固定在金电极表面，对甲型H5N1 流感病毒进行检测，用OSWV 记录杂交时产生的信号，检出限为0.08 fmol/L。

表1 具有代表性的光学检测方法及基本情况对照

图2 伏安法检测结核分枝杆菌示意图[14]

1.2.2 电阻抗法

电阻抗法是近年来发展起来的一项电化学技术，其和微生物检测相结合形成一个独立的研究领域[17]。电阻抗技术是根据微生物在培养基中代谢活动的不同，通过检测培养基电阻抗的变化，判定细菌的生长繁殖特性，即可检测出相应细菌。Wheeler 等[18]使用一种基于阻抗变化原理的电压检测器检测培养基或尿液标本中的大肠杆菌，检测范围为1×103～1×109cfu/ml，这项技术省略了平板计数等方法漫长的实验过程，在10～15 min 内即可确定细菌浓度，可有效用于临床菌尿症标本检测，缺点是无法检测代谢物的变化。András 等[19]研制了一种超灵敏基于聚糖的阻抗生物传感器，用于流感病毒H3N2 检测，其检出病毒颗粒的浓度约为13 个/μl。Maalouf 等[20]利用生物素-亲和素的特性将大肠杆菌抗体与金电极表面的自组装膜结合，用电化学阻抗传感器（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）可检测出1×103cfu/ml 大肠杆菌。EIS 方法灵敏度高、特异度强，在生物传感POCT 中有广阔的应用前景。

1.2.3 电压或电流法

电压或电流法是将电极与电位计或电流计连接，记录工作电极上的电位或电流，随着电解池中氧化还原反应的进行并通过适当的媒介，将微生物的氧化还原反应转换为可测量的电信号[13]。Sepunaru等[21]将纳米粒子作为传感器的一部分，通过银纳米颗粒所致的电信号变化检测流感病毒。由于产生的电流峰值大小与溶液中病毒的浓度成正比，因此可用于病毒等病原体的定量检测，优点是设备微型化、自动化，灵敏度高、选择性强、诊断时间短。尽管不能确定具体的病毒种类，但能简单区分病毒和细菌感染。

具有代表性的电化学检测方法及基本情况汇总详见表2。

1.3 磁学检测

1.3.1 电磁法

目前，有研究使用磁性纳米颗粒（magnetite nanoparticle，MNPs）构建有潜力的POCT 诊断平台，用于检测大肠杆菌[22]、流感病毒[23]、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌[24]和炭疽芽孢杆菌[25]。Shelby 等[23]利用包被聚丙烯酸涂层的超顺磁性氧化铁纳米粒子设计能够检测和区分各种流感病毒糖蛋白的磁弛豫纳米传感器（magnetic relaxation nanosensors，MRnS），通过收集并分析横向弛豫时间来进行研究。MRnS 能区分糖蛋白变异体，可检测浓度低至1 nmol/L 的流感病毒糖蛋白（H1 和H5）。此外，MRnS 可在30 min 内完成检测，操作简单、便携，只需要一个台式磁弛豫仪即可进行样品分析。MRnS 具有稳定和成本低廉的特点，有望成为有价值的POCT 候选诊断方法。Krishna 等[26]构建了基于单克隆抗体和磁性纳米粒子的巨磁电阻（giant magnetoresistance，GMR）生物传感器（如图3所示），可用台式计算机通过检测磁场变化来检测甲型流感病毒，MNPs 的数量与甲型流感病毒的数量成正比。该方法灵敏度优于ELISA，病毒浓度最低检出限为1.5×102TCID50/ml。此外，GMR 生物传感芯片包含64 个磁珠阵列计数器，可与各种抗体结合检测病毒的不同亚型，甚至可以同时检测多种病原体，虽然检测时间较长且操作复杂，但有发展为手持生物传感POCT 设备的潜力。

表2 具有代表性的电化学检测方法及基本情况汇总

图3 GMR 芯片[26]

1.3.2 磁光法

磁光效应是指在磁场作用下，物质的磁性（磁导率等）发生变化，使光在其内部的传输特性（偏振状态、传输方向等）也随之变化的现象。Bejhed 等[27]运用磁光技术，可在20 min 内完成浓度为5 pmol/L 的霍乱弧菌检测，但滚环扩增反应60 min 后检测限仅为10 pmol/L。Tian 等[28]用bluray 磁光法3 h 内完成浓度低至8×104cfu/ml 的沙门氏菌检测，可以直接得到检测结果，而且检出限比磁杂散场检测装置低20 倍。Kim 等[29]利用塑料芯片-磁光免疫分析法检测结核杆菌，通过将塑料芯片与自动分光光度计装置相结合，可在1 h 内完成浓度低至1.8 pg/ml 的结核杆菌检测。磁光法因具有快速灵敏、使用简便、成本低廉和稳定性较好的特点，成为了新型生物传感POCT 检测的另一个潜在候选者。

具有代表性的磁学检测方法及基本情况汇总详见表3。

表3 具有代表性的磁学检测方法及基本情况汇总

2 3 种检测方法在传染病病原体POCT 应用中的优劣比较

光学检测具有高通量、集成化且可根据个人需要进行荧光标记的特点，但仍存在局限性，例如在样本准备过程中荧光分子固有的本底干扰多且不易去除，荧光检测仪费用昂贵。另外，现有的SPR 技术与传统分析方法相比，在稳定性、易用性、灵敏度、检测效率及成本等方面还存在一些不足[30]。POCT 诊断工具的目标是使用原始样本，如血液、血清或尿液，尽量减少样本前处理过程，而光学检测方法样本前处理过程一般较为复杂且需专业人员操作，因此进一步限制了光学生物传感POCT 平台在资源有限环境中的应用。

电化学技术具有成本低、可批量生产、灵敏度高及一次性可抛的特点，但研发时间较长、寿命短、选择性差。虽然目前已研发出具有便携性和精确性的病原体检测原型机，但在评估有效性方面还存在一些困难[31]。

磁性纳米粒子检测克服了荧光检测的许多不足，可用于非透明和未经处理的样本。此外，磁性纳米粒子具有超顺磁性、高磁化率、高矫顽力与低居里温度等特性[32]，并且可被磁场操控，在研发各种诊断工具时可以进行丰富的个性化定制。然而，仪器缺乏便携性和成本问题限制了该类平台的应用。

3 种检测方法主要的优缺点汇总详见表4。

表4 3 种检测方法优缺点比较

3 结语

因具有高通量和高速传输的特点，基于光学的生物传感POCT 平台具有很大的潜力，但成本、样本处理及专业性等问题限制了其在资源有限环境中的应用，现多与电化学技术结合用于病原体的即时检测。电化学技术在传染病病原体生物传感POCT 方面最具发展潜力，该类生物传感器逐渐向小型化和便携化方向发展。磁性纳米粒子因其独特的化学和物理性能，在病原体即时检测方面有一定的应用前景。每种检测方法都能够成为有效的生物传感POCT诊断工具，从而实现传染病病原体的快速检测。

尽管如此，生物传感POCT 技术与设备在传染病病原体检测中仍存在以下问题：（1）灵敏度和准确性有待提高；（2）检测病原体的类型较为单一，单次检测的样本数量少；（3）目前多处于实验室研究阶段。可以预见，传染病病原体生物传感POCT 未来发展趋势：（1）灵敏、快速、高度集成化，实现加样检测一体化；（2）配备自动化、小型化，在偏远疫区非专业人员也可轻松操作；（3）控制智能化、远程化，通过便携式计算机或手机即可启动或停止检测；（4）多元化、高通量、多种技术联合检测。

综上所述，通过聚焦于低成本、高通量、高准确性、高灵敏度及便携性，建立有效的评估方法，加快新技术研发，生物传感技术将会在传染病病原体POCT 方面得到更广泛的应用。