梁昊岳，张 森，任彦松，王艳生，于文颖，杨晚竹，陈 婷，高瀛岱

（中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，天津300020）

0 引言

流式细胞术及流式细胞仪不仅为人类探索微观世界、认识细胞特征提供了强有力的检测手段，还促进了细胞生物学的发展，并辐射到免疫学、血液学、遗传学、肿瘤学和干细胞等多个医学研究领域[1-4]。造血干细胞具有自我更新能力，可以进一步分化，最终生成红细胞、白细胞和血小板等各种血细胞成分。造血干细胞研究是干细胞研究的重要组成部分，有助于治疗白血病等各种血液系统疾病[5-7]，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。造血干细胞研究中涉及干细胞的分析和分选，本文概括流式细胞仪在造血干细胞研究中的应用价值，比较6 种不同型号的流式细胞仪在造血干细胞分析和分选应用中的差异，并对影响造血干细胞流式分析、分选的因素进行归纳，以期对流式细胞仪在造血干细胞研究中的应用和实验血液学研究工作起到参考作用。

1 流式细胞仪的构造和工作原理

1.1 流式细胞仪的构造

流式细胞仪主要由激光光源，流动室和液流系统，光学检测系统，信号检测与存储、显示、分析系统，分选系统5 个部分构成。

1.2 工作原理

1.2.1 激光光源

大多数流式细胞仪使用激光束作为光源来激发与样本中的细胞结合的荧光标签，如荧光抗体。可产生蓝光的氩激光器是最常用的激光光源，部分流式细胞仪添加了红色氦氖激光器，偶尔也会用汞弧灯代替激光光源。

1.2.2 流动室和液流系统

流式细胞仪中通过流动室的液体来源有2 个：一为鞘液，通常是缓冲盐水；二为样品，含有待分析的细胞。鞘液包裹样品并将样品芯压缩在较小区域内在流动室被检测。

1.2.3 光学检测系统

光学检测系统主要由激光、棱镜和滤光片组成。当激光照射到细胞时，在细胞边缘周围衍射，产生沿激光束路径的衍射图案。一系列棱镜和滤光片可以处理荧光（激光照射样品后产生的信号），经长通滤光片、短通滤光片和带通滤光片等处理后的光信号被光电倍增管接收。

1.2.4 信号检测与存储、显示、分析系统

光电倍增管（也称为通道）收集来自细胞的光信号并转换为电信号，电信号再由模数转换器转换为数字信号。转换后的电信号可在计算机上存储、显示和分析。

1.2.5 分选系统

在流式分析的基础上，流式细胞仪可以给目标细胞所在的液滴加电荷，被加电荷的液滴经过分选仓偏转板时会依据所加电荷种类和数目的不同发生偏转，从而被收集管或微孔板收集，达到细胞分离、纯化的目的。

2 应用流式细胞仪研究造血干细胞的原理

造血干细胞和分化的各种血细胞具有不同的表面标记[8-10]，如人造血干细胞表面标记表现为CD34+CD38-，小鼠造血干细胞表面标记表现为Lin-c-kit+sca-1+，小鼠长周期造血干细胞表面标记表现为Linc-kit+sca-1+CD34-flk-2-或Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48-，小鼠短周期造血干细胞表面标记表现为Linc-kit+sca-1+CD34+flk-2-。流式细胞仪通过检测细胞表面标记来鉴别造血干细胞，从而实现对造血干细胞的分离和富集，如图1 所示。

图1 造血干细胞流式分选结果

3 流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用

3.1 造血干细胞造血功能的研究

3.1.1 造血干细胞多向分化功能的研究

造血干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。依据血液系统各系细胞的表面标记不同，如人体T 淋巴细胞分化抗原为CD4 和CD8，B 淋巴细胞分化抗原为B220，粒细胞分化抗原为Gr-1，单核细胞分化抗原为Mac-1，流式细胞仪可以检测血液系统各系细胞的分化水平。通过检测各系细胞的分化水平，可以分析造血干细胞的造血功能（小鼠造血干细胞移植后各系细胞的分化结果如图2 所示）。由此，通过流式细胞术可研究造血干细胞的多向分化功能。

3.1.2 造血干细胞自我更新功能的研究

通过对小鼠单细胞造血干细胞移植后全骨髓二次移植，可以验证造血干细胞的自我更新能力，其各系细胞的分化结果如图3 所示。造血干细胞自我更新功能研究的理论基础在于单个造血干细胞移植后，如无自我更新，则该造血干细胞会分化成祖细胞，进而向各系细胞进行分化，造成二次移植无阳性造血重建效果。

图2 小鼠造血干细胞移植后各系细胞的分化结果

3.2 靶基因对造血干细胞命运的研究

通过利用条件敲除鼠和基因过表达小鼠，可以分析某一靶基因对干细胞命运的影响，包括自我更新、分化、凋亡等。以导入luciferase 基因的小鼠为例，可用于观察造血干细胞移植后在受体小鼠中归巢的过程，利用小动物活体成像技术追踪小鼠骨髓重建造血系统的过程，探究靶基因对造血干细胞命运的干预和影响[11]。

3.3 造血干细胞细胞周期的研究

特定的基因可以调节造血干细胞的自我更新能力。利用流式细胞仪可以检测标记了Hoechst33342的造血干细胞的细胞周期，以分析其自我更新能力[12-14]。流式细胞仪结合FlowJo 或ModFit 软件进行细胞周期的数据分析，可以获得G0/G1、S、G2/M 期比例。如加入Ki67 或Pyronin Y（PY）等染料，可以完成对G0 期和G1 期的区分。

3.4 通过小鼠白血病模型的建立研究药物等因素对造血干细胞分化功能的影响

利用流式细胞仪分选获得小鼠造血干细胞后，用含有白血病致病基因如Notch 基因的病毒感染造血干细胞，进行无菌体外培养，再接种到小鼠体内，等待小鼠发病。将发病小鼠的造血干细胞分选后，进行二次移植，即可获得稳定的小鼠白血病模型。借助此模型可以进行白血病药物及相关敏感度的研究。同时，还可通过流式检测白血病小鼠的干细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，研究外部因素对造血干细胞增殖、分化的影响机制[15-16]。

4 流式细胞仪的比较与造血干细胞流式检测结果影响因素分析

4.1 不同型号流式细胞仪在造血干细胞研究中具有不同功能

不同厂家生产的不同型号的流式细胞仪可搭载不同数目的激光器、配置不同的荧光检测通道，在造血干细胞流式分析、分选实验中发挥着不同的功能，详见表1。以流式细胞仪配置为依据，设计造血干细胞流式检测方案，可在实验电压设置、圈门和荧光补偿调节中实现精准检测，具有重要的科研价值。

4.2 造血干细胞检测结果影响因素分析

4.2.1 实验室检测人员技术水平与经验

实验室检测人员的技术水平与经验对造血干细胞的分析、分选有着重要影响。在使用流式细胞仪之前，实验室检测人员需根据仪器手册对仪器进行各项参数的设定，分选前需用荧光微球调节最佳的延迟时间（delay time）；在检测过程中，还需按要求调节荧光补偿（compensation）。因为造血干细胞在样本中所占比例较低，分群不是十分明显，所以对实验室检测人员圈门等操作的经验要求较高。只有参加过科研技术平台流式中心规范的流式细胞仪培训并有较长时间流式分析、分选经验的检测人员，才能够准确找到并圈选出造血干细胞的细胞群。

4.2.2 检测仪器的配置

稳定的仪器状态是准确分析样本、完成细胞分选的前提。较高的仪器配置、较多的激光器和荧光分析通道会使造血干细胞的分析和分选更为方便。以BD LSRⅡ、BD LSRFortessa、BD AriaⅢ、BD Influx 流式细胞仪为例，因其配备了包括紫外激光器在内的3 个及以上激光器，拥有10 个左右的荧光分析通道，且荧光素选择范围大，所以用以检测造血干细胞的使用频率较高。而Beckman Epics XL、BD CantoⅡ流式细胞仪因未配备紫外激光器且荧光分析通道较少，故用来检测造血干细胞的频率较低，且不方便检测造血干细胞周期。BD AriaⅢ、BD Influx 流式细胞仪因具备细胞分选功能，可以进行造血干细胞的高速分选。

4.2.3 检测试剂的选择

选择不同的检测试剂，即使用不同的抗体和荧光素分析、分选造血干细胞，其结果也有所不同。即使经过磁珠分选富集之后，造血干细胞占样本中的比例仍然较低，且造血干细胞表面标记CD34 等阳性较弱，故需使用荧光信号较强的荧光素（如PE）以更好地区分阳性细胞和阴性细胞。若使用荧光信号较弱的荧光素，则有可能给圈选阳性细胞带来困难，造成阳性率统计不准确。此外，裂解红细胞使用的裂红液配置也会影响造血干细胞的检测结果。

4.2.4 样本处理方法

在进行流式分析、分选之前，样本的处理也对实验结果有着重要影响。样本处理过程中选取的荧光抗体量、抗体孵育时间、裂解红细胞时间、洗涤次数等都是重要的影响因素。如样本处理过程中加入的荧光抗体数量不足或孵育时间过短，会使干细胞表面抗原与抗体结合不足，阳性比例减少，导致流式分析、分选结果不正确；裂解红细胞时间过长或洗涤次数过多，会造成细胞死亡，导致处理过程中细胞丢失，其流式分析、分选的结果也不完全可信。建议抗体孵育时间以30 min 左右为宜，裂解红细胞时间以15～20 min 为宜，洗涤次数以用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2 次为宜。

图3 小鼠单细胞造血干细胞移植后全骨髓二次移植后各系细胞的分化结果

表1 部分流式细胞仪型号和功能对比

5 结语

近年来，干细胞研究逐渐成为我国细胞生物学研究的热点。造血干细胞既具有自我更新能力，又能产生淋系/髓系祖细胞，而祖细胞又能以特定的顺序依次分化为各种成熟血细胞，用于造血和免疫功能重建。同时，造血干细胞具有较好的可塑性，可以转变为肝脏、脂肪、肌肉、血管、神经等细胞，在治疗冠心病、神经损伤等疾病方面有着广泛应用。传统的造血干细胞移植可以治疗白血病、重症再生障碍性贫血等重型血液病以及实体瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病等，具有重要的科研和临床意义[17-21]。

流式细胞术作为造血干细胞研究的重要技术手段，一直发挥着重要作用。流式细胞仪具有准确、高速、灵敏、多激光、多参数同时分析等优点，已成为细胞生物学研究，特别是造血干细胞生物学研究中不可或缺的重要手段。随着科学的进步和发展，流式细胞仪的功能和流式技术软件的设计更加强大，为其更好地应用于造血干细胞的研究、创新工作提供了坚实保证。

本文探讨了流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用，为多激光多色流式分析和高速、高通量流式分选技术研究提供了思路。相信在不久的将来，在科学技术不断创新和发展下，流式细胞仪将在生命科学和医学研究中发挥更加重要、不可替代的作用，具有更加广阔的应用前景。