孔令米 刘会 李俊雅 玄红专

（聊城大学生命科学学院，聊城 252059）

蜂胶是蜜蜂从植物嫩芽和枝条的表面或伤口处采集的树脂，再混合蜂蜡、花粉及自身分泌物质等形成的一种具有树脂芳香味的天然活性物质。蜂胶中富含多种黄酮类、萜烯类和酚酸类等具有药理活性的天然成分[1-3]，这些生物活性成分赋予蜂胶多种药理学功能，例如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、免疫调节[4-6]等。

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，对全球人类健康造成严重威胁。尽管当前临床治疗方式多种多样，但是肺癌的存活率仍然很低，多数病人死于远端转移，对人类健康危害极大[7]。蜂胶作为一种天然活性产物在抗肿瘤方面具有突出功效，且无明显毒副作用。研究发现中国蜂胶中的黄酮类和酯类化合物具有明显抗肿瘤功效[8]，具有非常好的应用价值。

本研究利用中国蜂胶及其主要组分（咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素）对两种肺癌细胞A549和H1299的抗癌作用及机制进行了分析，为蜂胶的抗肿瘤活性研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中国蜂胶产自山东省，主要胶源植物为杨树。主要试剂包括：RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰酶、磺酰罗丹明B（SRB）（sigma公司）；Hoechst 33258、活性氧检测荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）和线粒体膜电位荧光探针JC-1（美国Sigma公司）；抗体Caspase-3、PARP（美国Cell Signaling Technology）、β-actin（美国Santa Cruz Biotechnology）；其他试剂均为分析纯。

A549、H1299细胞由本试验所在实验室保存。

1.2 试验仪器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；TE2000S 倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Olympus）；电泳仪和电转仪（Bio-Rad公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 蜂胶乙醇提取物（EECP）的制备

中国蜂胶来自山东省，主要胶源植物为杨树。中国蜂胶经冷冻、粉碎、95%（v/v）酒精浸提24h，减压过滤，滤液经40℃旋转蒸发浓缩至恒重，放入-20℃冰箱中保存，使用时用95%酒精溶解。蜂胶中主要组分咖啡酸苯乙酯（CAPE）、白杨素、芹菜素、高良姜素均从蜂胶水提物中分离提纯，并经紫外光谱（UV）和核磁共振（NMR）鉴定，纯度为98%以上[9]。

1.3.2 细胞培养

肺癌A549和H1299细胞均培养在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，孵育条件为：5% CO2、37℃、饱和湿度CO2培养箱中。倒置荧光显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 细胞存活率的测定

将处于对数生长期的细胞按4000个/孔种植到96孔板，待肿瘤细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理48h后，弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，然后用SRB染色10min，晾干，100mmol/l Tris碱溶解，在492nm处测吸光值。

细胞存活率（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%

1.3.4 Hoechst33258染色

将处于对数生长期的A549和H1299细胞按4×104个/孔种植到24孔板中。待肿瘤细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理24h。弃细胞培养液，用1×PBS轻轻润洗1次，加入Hoechst 33258工作液500μl，于CO2培养箱中孵育30min。弃染色液，用1×PBS轻轻润洗2次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.5 Transwell小室体外侵袭实验

取对数生长期的A549和H1299细胞，消化，调整细胞密度到5×105/ml，transwell上室加入200μl细胞悬液，下室中加入600μl含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃孵育24h。用湿棉签擦掉上室上面的Matrigel和非侵袭细胞，上室下面用0.1%结晶紫固定染色30min，高倍镜下计数穿过微孔膜的细胞数。直径上取4个视野，求其平均值。

1.3.6 活性氧（ROS）水平的检测

将处于对数生长期的A549和H1299细胞按4×104个/ml种植到共聚焦小皿中。待细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理24h。弃细胞培养液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA应用液1ml，37℃孵育30min。弃DCFH-DA应用液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.7 线粒体膜电位检测

将处于对数生长期的A549和H1299细胞按4×104个/ml种植到共聚焦小皿中。待肿瘤细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理24h。弃细胞培养液，用1×PBS清洗，加JC-1染色液500μl，37℃孵育20min。弃JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.8 细胞蛋白提取及蛋白质免疫印迹（Western Blotting）

EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理24h后收集各组细胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30min，用BCA法测定总蛋白浓度。取30~40μg总蛋白提取物上样，经12% SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温下封闭1h，然后加入caspase 3、PARP和β-actin一抗稀释液（1∶1000）于4℃冰箱孵育过夜。用1×PBST洗膜3次，每次5min；再加入二抗，室温孵育1h，1×PBST洗膜3次，每次5min采用ECL显色。Quantity One进行蛋白定量分析。

1.4 数据统计

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±S）表示，用t检验进行统计学分析。P < 0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 中国蜂胶及其主要组分对H1299细胞存活率的影响

前期我们已经检测了蜂胶及其主要组分对肺癌A549细胞存活率的影响[9]，蜂胶及其主要组分对H1299细胞存活率的影响如图1-1、1-2和1-3所示。

由图1可以看出，蜂胶及其主要组分CAPE、芹菜素、白杨素和高良姜素在24h和48h显著抑制H1299细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性（*P<0.05，**P<0.01）。结合前期蜂胶及其主要组分对A549细胞的影响，可以看出蜂胶及其主要组分对两种肺癌细胞均具有较好的抑制功效。

图1-1 EECP在24h和48h对H1299细胞存活率的影响

图1-2 蜂胶中主要组分在24h对H1299细胞存活率的影响

图1-3 蜂胶中主要组分在48h对H1299细胞存活率的影响

2.2 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞侵袭的影响

肿瘤细胞的侵袭和转移是肿瘤治疗中的难点。由图2可以看出，EECP及蜂胶主要组分处理A549和H1299细胞24h后，显著抑制两种肿瘤细胞的侵袭，且咖啡酸苯乙酯、白杨素和芹菜素效果尤为显著。

图2 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞侵袭的影响

2.3 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞凋亡的影响

前期我们已经证明蜂胶及其主要组分能显著抑制多种肿瘤细胞增殖[9]。经Hoechst33258染色可以看出，两种肺癌细胞（A549和H1299）经EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）分别处理24h后，细胞数量减少，细胞凋亡显著上升，且细胞核出现显著的核染色质浓缩和破裂现象（图3）。

图3 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞凋亡的影响

2.4 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞凋亡蛋白表达的影响

Caspase酶家族在凋亡信号传导过程中发挥关键作用[10]。PARP剪切被认为是细胞凋亡的另一个重要指标，也通常被认为是Caspase-3激活的指标。EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素、高良姜素（80μM）对PARP和caspase 3的影响如图4所示。在A549和H1299两种细胞中，蜂胶及其主要组分显著上调凋亡执行者caspase 3的水平，而未剪切的PARP水平显著降低（*P<0.05，**P<0.01）。

图4 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞中PARP、Caspase 3蛋白表达的影响

2.5 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞中ROS水平的影响

细胞内ROS过多积累，在细胞凋亡、分化和增殖中发挥重要作用[11]。由图5可以看出，H1299细胞经中国蜂胶及其主要组分处理24h后，ROS水平显著上调，但在A549细胞中，咖啡酸苯乙酯对ROS水平影响不显著，其他几种组分如白杨素、芹菜素和高良姜素及EECP显著上调ROS的水平（*P<0.05，**P<0.01）。

图5 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞中ROS水平的影响

2.6 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞内线粒体膜电位的影响

细胞内ROS过多积累会引起线粒体的损伤，导致线粒体膜电位的下降。线粒体膜电位的下降出现在细胞形态学改变之前，是凋亡的早期表现[12]。本研究采用线粒体膜电位荧光探针JC-1，通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，结果如图6所示。在H1299细胞中，EECP对线粒体膜电位影响较显著，其他组分如白杨素和芹菜素对A549细胞中线粒体膜电位影响不显著。在H1299细胞中蜂胶及其主要组分显著降低线粒体膜电位水平（*P<0.05，**P<0.01）。

图6 中国蜂胶及其主要组分对A549和H1299细胞内线粒体膜电位的影响

3 讨论

肺癌是一种恶性肿瘤，严重危害人体健康。尽管肺癌治疗手段不断进步，总体生存率、生存期不断延长，但肺癌治疗成本仍较高。蜂胶是一种药用价值较高的天然产物，具有较好的抗肿瘤功效，对多种肿瘤具有显著的抑制功效。

肺癌转移是肺癌的恶性标志和生物学特征，也是导致肺癌病人治疗失败和死亡的主要原因。本研究发现中国蜂胶乙醇提取物及其主要组分咖啡酸苯乙酯、白杨素、芹菜素和高良姜素显著抑制两种肺癌细胞A549和H1299的侵袭和浸润，表明了蜂胶及其主要组分抑制肺癌转移的潜在功效。此外，蜂胶及其主要组分显著促进两种肺癌细胞的凋亡，其促凋亡效果与蜂胶及其主要组分能够活化促凋亡基因，促进细胞内活性氧的积聚，破坏线粒体膜电位进而诱导肺癌细胞凋亡有关。

蜂胶的化学成分非常复杂，从两种肺癌细胞的抑制功效可以看出蜂胶药效体现的是综合效应和整体疗效，蜂胶整体药效的发挥不是单一成分药效的简单叠加，而是存在着复杂的相互作用和协同功效[13]。蜂胶的抗肿瘤作用机理也很可能是多网络、多靶点的[14]，蜂胶抑制肺癌细胞增殖是否对其他信号通路及其靶点发挥功效还需要进一步发掘、研究。