吴玉花，丁欣，李小露，高红凤，冯炜，白红存，郭庆杰

（宁夏大学化学化工学院，省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，宁夏 银川750021）

引 言

从黄连中高效提取获得小檗碱等生物活性物质对于中药资源有效利用具有重要意义[1-2]。早在数千年前的古代中国，人们已经发现黄连（一种多年生草本植物）可作为清热解毒和抗感染药物主治肠道细菌感染等疾病。近代临床药理学研究发现黄连还具有抗心律失常、降血糖、降血脂、抗癌、抗病毒等药理作用，可用于心律失常及病毒性心肌炎、心力衰竭、高脂血症、癌症等的治疗。现代医药学研究表明，黄连所表现出来的临床药用价值与其根部所含的异喹啉类生物碱密切相关[2-3]。黄连中的生物碱成分包括黄连碱、巴马丁、药根碱、小檗碱、表小檗碱等，具有重要的药用价值。然而，黄连中所发现的生物碱大部分为异喹啉类，化学结构相似性较高，理化性质也较为相近，导致高效提取难度增大[1-2]。

小檗碱是从黄连诸多生物碱成分中可获得的含量最高的一种，其高效提取具有重要学术和应用价值。目前由黄连中提取小檗碱常用方法包括稀硫酸渗漉法、乙醇回流提取法、超声提取法、连续回流法、煎煮法等工艺[4-6]。然而，这些方法具有耗时较长、操作复杂、效率低等缺点，而且所用试剂对环境不友好，难以满足绿色化工提出的高效、可持续发展理念。

离子液体作为绿色介质具有液态范围宽、挥发性小、蒸气压低、溶解能力强、无味、无污染、不易燃、易与产物分离、易回收、可反复循环使用等优良性能，在反应溶剂、催化、吸附与分离等领域表现出优异性能[7-10]。随着生成成本的不断降低，离子液体在天然活性物质提取中显示出良好的前景。Duan等[11]采用离子液体负压空化辅助方法从木豆根中提取三种主要黄酮类化合物，并实现中试级别应用。Li等[12]基于离子液体水溶液超声辅助方法研究了黄柏中三种生物碱提取。李明英[13]对近年来离子液体在天然活性物质提取中的应用进行了研究进展的综述和展望。另一方面，微波作为一种新的辅助手段，因萃取速度快、效率高、选择性好等特点而受到广泛关注[14]。最初微波技术主要用于无机分析中的样品预处理，后期逐渐将其应用到有效成分提取。利用微波加热可加速强化溶剂对固体样品中的目标提取物尤其天然有机化合物的提取。将微波法应用到天然药物有效成分的提取，更有利于对药物活性成分的分析及研究。近年来，利用微波能量从天然产物中提取重要成分受到了研究人员的重视[15-18]。特别是利用离子液体和微波辅助方法在天然产物有效成分提取的报道逐年增多。李攻科等[17]以离子液体的水溶液为提取剂，通过微波辅助法对石蒜中的石蒜碱、力克拉敏和加兰他敏生物碱等物质的提取进行了研究。发现相较于传统加热回流和其他溶剂萃取，离子液体溶液微波辅助萃取具有快速、高效、无环境污染的优点。Lu 等[18]采用微波辅助提取法，以1-烷基-3-甲基咪唑为阳离子的离子液体-水溶液为提取剂，对莲子心中酚醛碱提取进行了研究，发现与传统提取法和一般溶剂微波提取法相比，离子液体微波辅助方法快速高效，且具有较高提取率。

本研究以黄连为研究对象，采用离子液体-微波辅助联合方法，提取有效成分小檗碱，实现提取的高效过程强化。研究以离子液体-水溶液为溶剂的微波辅助提取法，考察微波时间、操作温度、溶液pH 等工艺条件以及离子液体种类选择等对提取收率的影响。基于现代密度泛函理论的分子模拟，研究微波外场和不同离子液体与小檗碱的相互作用，揭示复合体系组分之间相互作用的物理本质。

1 实验与计算模拟

1.1 试剂与仪器

主要试剂：黄连购自宁夏药材公司；盐酸小檗碱标准品购自中国食品药品检定研究院；[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[HMIM]Ac、[OMIM]Ac、[DMIM]Ac 五种咪唑类离子液体购自中国科学院兰州化学物理研究所，纯度>99%；乙腈（色谱纯）和磷酸（分析纯）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

主要仪器：微波合成仪（MAS-II 型），上海新仪微波化学科技有限公司；数显电动离心机（80-4型），常州国华；微型植物粉碎机（FZl02 型），北京中兴伟业仪器有限公司；酸度计（PB-10型），北京赛多利斯科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（1100型），美国安捷伦公司；计算服务器，双路Intel 志强E5-2600V3系列。

1.2 实验方法

离子液体-微波辅助萃取：将干燥块状黄连粉碎研磨，过100 目（149 μm）筛，置于棕色磨口瓶备用。使用分析天平准确称量约0.2 g黄连粉末，置于三颈瓶中。向其中加入一定量萃取溶剂，在微波反应器内，待设定完功率、温度、时间后，在磁力搅拌下进行提取。完成后静置冷却至室温，离心10 min，使用0.45 μm 滤膜过滤。取一定量上清液定容到50 ml容量瓶中配制待测液，并使用高效液相色谱法（HPLC）测定其中含量。研究中首先进行单因素实验的考察，在此基础上确定较优提取工艺。

在上述实验条件下小檗碱以盐酸盐形式存在。使用HPLC 检测盐酸小檗碱含量最佳条件为：流动相为磷酸二氢钠溶液(浓度0.05 mol/L，pH=2.5)和乙腈体积比为70:30；固定相为C18柱；柱温25℃；波长264 nm。在HPLC 谱图中盐酸小檗碱出峰时间约为11.6 min，此时能得到很好盐酸小檗碱的分离。使用盐酸小檗碱标准品配制系列不同浓度的溶液并进色谱柱，测定峰面积，绘制标准曲线，回归方程为y=1001.10x+10.49，R2>0.9999。根据标准曲线即可获得不同提取液中盐酸小檗碱的含量。

小檗碱的提取收率（yield，mg/g）在本研究中定义为：

式中，m*(mg)和m0(g)分别为HPLC 测定的待测液中盐酸小檗碱质量和黄连样品质量；V0和V1分别为提取液定容体积和待测提取液体积，ml。

1.3 分子模拟方法

分别构造小檗碱和离子液体单独模型以及复合体系模型。利用密度泛函理论（DFT）在M06-2X/6-31G**基组水平上分别对单独体系和复合体系进行几何构型全优化，并进行能量和电子性质计算，所有计算均使用Gaussian16程序完成。需要指出的是，DFT 方法中常规的广义梯度泛函（如PBE、BP86、PW91等）和一般杂化泛函(如B3LYP 和PBE0等) 方法不能较为精确地描述弱相互作用体系，而本研究使用M06-2X 方法[19-21]被证明对于非共价相互作用的描述甚至能够接近非常精确的耦合簇(CCSD)方法[22]。本研究中分子模拟计算中使用外加电场方式模拟微波行为。这是当前模拟计算微波外场的常用方法，并得到了较为广泛的认可[14,23-24]。为了更深入研究离子液体和小檗碱之间的相互作用本质，对复合体系的约化密度梯度（RDG）[25-26]进行了分析和讨论。

2 实验结果与讨论

2.1 不同离子液体的影响

本研究选取[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[HMIM]Ac、[OMIM]Ac、[DMIM]Ac 五种常用离子液体用于从黄连中提取小檗碱。在离子液体浓度0.5 mol/L、固液比1∶70（质量(g)∶体积(ml),下同）、溶液pH=4、微波时间8 min、提取温度60℃和微波功率300 W 的相同工作条件下，获得不同离子液体微波辅助从黄连中提取小檗碱的收率如图1 所示。由图可见，五种离子液体水溶液用于从黄连中提取盐酸小檗碱收率达到30.6～58.9 mg/g。根据报道[27]，不同黄连样品中小檗碱含量约为7%。本研究最优工艺下收率为58.9 mg/g，按此计算提取率可达到84%。与其他条件相同而水溶液中不加离子液体的提取收率25.3 mg/g 相比，离子液体的加入使得小檗碱提取收率显著提升。可见，离子液体对于从黄连中提取小檗碱具有明显的过程强化作用。

图1 不同离子液体条件下提取收率Fig.1 Extraction yield by different ionic liquids

图2 咪唑类离子液体的阳离子分子结构Fig.2 Molecular structures for imidazole cation of ionic liquids

不同种类的离子液体表现出不同程度的提取收率提升效果。所选用的五种阴离子为醋酸根的离子液体中，[OMIM]Ac的提取效果明显优于其他离子液体。这可能与不同种类的离子液体自身结构和性质具有一定关联。从分子结构的角度考虑，本研究所考察的五种离子液体均为甲基咪唑醋酸盐类。它们具有相同的阴离子结构，主要差异在于阳离子中咪唑环取代烷基中碳链的长度不同（图2）。当离子液体阳离子取代烷基中碳链长度从C2 乙基逐渐增加至C6 己基时，提取收率由30.6 mg/g 增加至34.1 mg/g，呈现小幅增加趋势。当取代烷基碳链进一步延长至C8辛基时，提取收率迅速增加达到峰值（58.9 mg/g）。随后，当取代烷基碳链长度进一步增加到C10 癸基时，提取收率降低至39.5 mg/g。可见，离子液体阳离子取代烷基中碳链的长度对于提取收率的确具有重要影响。从微观分子构效关系的角度出发，甲基咪唑类阳离子为典型两亲性表面活性物质，其中甲基咪唑为亲水集团，而相应链状烷基为憎水集团。随着烷基碳链长度的增加，溶解度会出现降低现象，传质阻力随之增加。Shiflett等[28]对阴离子为TFES 的系列甲基咪唑离子液体溶解度的测试表明[DMIN]溶解度低于[HMIN]，也验证了该结论。其主要原因在于离子液体阳离子中烷基碳链过长时，离子液体溶液的表面吸附现象更加明显，进而影响离子液体在水中的均一性和分散性。因此使用[DMIM]Ac 离子液体溶液时提取收率较[OMIM]Ac出现降低现象。这里使用[OMIM]Ac的提取收率明显优于其他离子液体，故后续研究选择该离子液体。

2.2 不同溶剂及加热方式的提取收率比较

为考察不同工艺条件对黄连中小檗碱提取率的影响，在固液比1∶70、溶液pH=4、加热时间8 min、提取温度60℃和微波功率300 W 的相同工作条件下，分别研究水溶液常规加热、水溶液微波加热、乙醇溶液(0.5 mol/L)常规加热、乙醇溶液(0.5 mol/L)微波加热和[OMIM]Ac 离子液体水溶液(0.5 mol/L)微波加热几种不同提取工艺条件对提取收率的影响。结果如表1 所示。由表中数据可见，不同溶液体系对提取收率影响较大。乙醇溶液整体较水溶液提取收率更低。而水中加入离子液体后，提取收率可进一步提高。其原因在于乙醇分子相比水分子而言极性较小。溶液极性一般可用溶剂分子的偶极矩衡量[29]。为此，本研究在M06-2X/6-31G**方法水平上分别对水分子和乙醇分子进行了第一性原理方法计算，获得水和乙醇单分子偶极矩分别为2.09 D 和1.58 D(1D=3.33564×10－30C·m)。该结果与实验测定数值（分别为1.86 D 和1.68 D）能够很好地对应。由此可见水分子的确较乙醇分子具有更大的偶极矩和分子极性，易于受外场作用而产生电子密度的极化作用。[OMIM]Ac 为咪唑类阳离子和醋酸阴离子构成的有机盐，比常规有机分子具有更大的极性。这与本文计算获得的[OMIM]Ac 离子液体偶极矩达到11.98 D 相符合。因此离子液体的极性显著大于水。一般而言，极性较强的体系在微波场中具有更明显的微波响应行为[14,30-31]。故离子液体的引入可实现从黄连中提取小檗碱收率的进一步提升。由此可见，离子液体和微波作为重要的辅助方法对于提取收率的提升都具有重要作用。

表1 不同工艺条件下黄连中小檗碱提取收率Table 1 Extraction yield of berberine hydrochloride under different conditions

2.3 提取工艺条件优化

2.3.1 固液比的影响 为考察固液比的影响，在离子液体浓度0.5 mol/L、溶液pH=4、微波时间8 min、提取温度60℃和微波功率300 W 的固定条件下，开展黄连粉末质量与[OMIM]Ac 离子液体水溶液在固液比分别为1∶10，1∶30，1∶50，1∶70，1∶90 时小檗碱提取实验。获得的提取收率结果如图3所示。随着固液比的增加，萃取率呈现先升后降的趋势。当固液比从1∶10 变化至1∶70 时，盐酸小檗碱提取收率由46.2 mg/g 增加至58.9 mg/g。其原因可能在于同等质量黄连加大离子液体用量，增加了小檗碱与溶剂的相互作用概率，使其更容易被萃取出来。当固液比为1∶90 时，提取收率略微降低（54.4 mg/g）。这可能是由于大量微波能量被过量溶剂吸收，黄连样品对微波能量的吸收相对减小，导致细胞壁破裂和传质受到负面影响[32]。因此，持续增加离子液体溶液无法进一步提高小檗碱的提取收率。且考虑到离子液体价格相对昂贵，用量增多成本升高。故选择黄连-离子液体溶液([OMIM]Ac,0.5 mol/L)的最佳固液比为1∶70。

图3 不同固液比的提取收率Fig.3 Extraction yield by different solid-liquid ratio

2.3.2 溶液pH 的影响 为考察溶液酸碱性的影响，在离子液体浓度0.5 mol/L、固液比1∶70、微波时间8 min、提取温度60℃和微波功率300 W 的相同工作条件下，将[OMIM]Ac 离子液体溶液pH 分别调节为1～7，进行黄连中小檗碱提取实验。获得的提取收率结果如图4 所示。当pH 在1～3 时，萃取率呈现增加趋势，但变化较平缓，萃取率仅由46.5 mg/g增加至47.5 mg/g。当溶液pH 增加至4时，提取收率显著提升，达到58.9 mg/g。当pH 在5～7 时，萃取率呈现下降趋势，但提取收率（48.6～50.4 mg/g）仍高于pH 在1～3 之间的结果。这可能是由于pH 会影响黄连中有效提取物在离子液体水溶液中的分配，进而影响提取率所致[33-34]。此外，咪唑类离子液体在不同pH 条件下会结合质子从而表现出不同的分子结构和极化性质，进而改变微波响应行为以及与小檗碱的相互作用。可见，离子液体溶液的pH 对提取效果仍具有一定影响。因此，取pH 为4最合适工艺条件。

图4 不同溶液pH的提取收率Fig.4 Extraction yield by different pH of solution

2.3.3 微波加热时间的影响 为考察微波加热时间对提取收率的影响，在固液比1∶70、溶液pH=4、提取温度60℃和微波功率300 W 的相同工作条件下，将浓度为0.5 mol/L的[OMIM]Ac离子液体溶液在微波加热时间分别为2、4、6、8和10 min下进行黄连中小檗碱提取实验。获得的提取收率结果如图5所示。根据温度为单因素的实验结果，发现微波加热时间对于盐酸小檗碱的提取收率具有一定影响。随着微波加热时间从2 min 延长至8 min，盐酸小檗碱的提取收率从55.0 mg/g 增加至58.9 mg/g，呈现稳步增加趋势。其可能原因在于微波加热尽管速度较快，但仍是一个逐级升温的过程。随着微波加热时间的延长，离子液体-水溶液体系与黄连样品接触时间和提取时间延长，这使得黄连中的小檗碱溶出更加充分。而当微波加热10 min 时，盐酸小檗碱提取收率为58.1 mg/g，略低于加热8 min 时相应收率。其可能原因在于黄连样品在微波场中吸收大量的能量，从而在细胞内部受过强热应力作用[14]，这使得部分有效成分在该过程中发生转化分解。故选择最佳微波加热时间为8 min。

图5 不同微波加热时间的提取收率Fig.5 Extraction yield by different microwave heating time

2.3.4 微波加热温度的影响 为考察温度对提取的影响，在离子液体浓度0.5 mol/L、固液比1∶70、溶液pH=4、微波时间8 min 和微波功率300 W 的相同工作条件下，将[OMIM]Ac离子液体溶液微波加热温度分别设定为30、40、50、60和70℃进行黄连中小檗碱提取实验。获得的提取收率结果如图6所示。当温度从30℃升高到60℃时，盐酸小檗碱提取收率呈现持续增加趋势，由51.2 mg/g 逐步增加至58.9 mg/g。当提取温度升高至70℃时，提取收率为57.5 mg/g，呈现小幅下降。温度在现代统计热力学上具有分子平均动能的统计学含义，可用于描述物体微观尺度上分子热运动的剧烈程度。在较高温度下，离子液体水溶液中的分子热运动比温度低时更加剧烈，因此提取的传质过程加速，可加快黄连中的细胞壁的破裂，强化离子液体与提取物的相互作用，使得小檗碱能够更有效地被萃取出来。需要指出的是，温度过高时需要增加额外动力消耗，使得成本增加。此外，过高温度下强热应力作用也可能导致小檗碱有效成分发生转化或氧化分解。因此，60℃为最合适的温度工艺条件。

图6 不同微波温度的提取收率Fig.6 Extraction yield by different microwave temperature

2.3.5 微波功率的影响 为考察提取微波功率对提取的影响，在固液比1∶70、溶液pH=4、微波时间8 min 和提取温度60℃的相同工作条件下，将浓度为0.5 mol/L 的[OMIM]Ac 离子液体溶液分别设定微波功率200～800 W 进行黄连中小檗碱提取实验。获得的提取收率结果如图7 所示。研究发现，当微波功率在200～700 W时，盐酸小檗碱提取收率变化幅度很小，为58.1～58.9 mg/g。其中，微波功率为300 W 时，提取收率58.9 mg/g 为最高。当微波功率为800 W时，盐酸小檗碱提取收率为56.7 mg/g，较200～700 W 时略有降低。其可能原因在于，微波功率在200～700 W 时，微波加热的升温较为平缓，能较稳定地达到所设定的温度。当微波功率为800 W时，微波仪器功率较高，温度控制不平稳，强热效应可能破坏小檗碱分子结构，降低提取收率。另外，随着微波功率增长，黄连植物细胞中更多种类的色素和胶质等也随之溶出，影响后续分离。结合绿色化学理念，选择微波功率300 W 为最合适工艺条件。

图7 不同微波功率的提取收率Fig.7 Extraction yield by different microwave power

2.4 离子液体与小檗碱相互作用模拟及分析

使用基于第一性原理密度泛函理论的自洽场分子轨道法在M06-2X/6-31G**基组水平上分别对小檗碱和本研究选用的五种离子液体单独体系以及相应复合体系首先进行几何构型全优化，获得各体系的平衡几何构型。为了直观刻画小檗碱与离子液体分子结构之间的相互作用，对优化完毕的复合体系进行Kohn-Shame 波函数计算，并基于约化密度梯度(RDG)方法对复合体系的分子间相互作用进行可视化分析[25,35]。RDG 分析采用约化密度梯度函数[表达式为1/(2×(3×π2)1/3)×|∇ρ(r)|/ρ(r)4/3，其中∇是梯度算符，|∇ρ(r)|即电子密度梯度的模]描述体系内部不同类型的相互作用。在RDG 等值面图中，蓝色区域ρ(r)>0、sign(λ2)<0，说明此区域表现为强吸引作用；绿色区域的ρ(r)=0，说明在此区域表现为范德华作用；红色区域ρ(r)>0、sign(λ2)>0，表现为强互斥作用。

小檗碱与[BMIM]Ac和[OMIM]Ac两种代表性离子液体的RDG 等值面和填色分析结果如图8 所示。由图可见，小檗碱的苯环和喹啉环中存在明显的红色棱形区域。这体现了六元环中较强的位阻效应，与散点图中对应（+0.01, +0.05）之间的红色部分相吻合。绿色和墨绿色片状明显分布在离子液体与小檗碱中间区域，以及离子液体阴阳离子之间。绿色和墨绿色区域的存在对应散点图中（-0.02,0.01）部分。这证实了离子液体的羧基、咪唑环以及醋酸根离子与小檗碱之间的弱相互作用主要表现为范德华力。此外，小檗碱分子的两个氧甲基之间也存在少量蓝色片状分布，对应散点图中的（-0.05, -0.02）之间的蓝色部分，该部分是小檗碱分子内部O…H 之间一种分子内氢键相互作用的体现。因此，RDG 等值面和散点分析形象直观地说明离子液体与小檗碱之间的作用力主要是弱相互作用，表现为范德华力。

表2 小檗碱与离子液体分子间相互作用的结合能Table 2 Binding energy of the berberine interacted with ionic liquids

图8 小檗碱与离子液体相互作用的约化密度梯度分析Fig.8 RDG analysis of berberine interacted with ionic liquids

为了进一步定量描述小檗碱与离子液体分子结构之间的相互作用，使用DFT 方法M06-2X 在6-31G**基组水平上对施加外场和外场去除情况下对本研究选择的五种离子液体-小檗碱复合体系的相互作用结合能进行计算和统计，结果如表2 所示。由表可知，离子液体与小檗碱的分子间相互作用结合能均为负值，即离子液体与小檗碱的相互作用为放热过程，二者的结合在能量上是有利的。无外场条件下，离子液体与小檗碱结合能在-90～-147 kJ/mol。施加外场作用后，离子液体与小檗碱复合体系的结合能数值明显增大，处于-689～-806 kJ/mol。由此可见，施加外场的确可增大离子液体与小檗碱间结合能，即离子液体与小檗碱分子之间结合更加紧密。此外，对比结合能数值可知，外场消除时离子液体与小檗碱分子结合能可快速大幅减小，便于二者的分离。此外，由表中数据还可以发现，在施加外场条件下五种离子液体中[OMIM]Ac 与小檗碱复合体系的结合能数值最大，即复合体系相互作用最强，易于获得较高提取率。这与前文提及的[OMIM]Ac 离子液体可获得最高提取收率能够很好地吻合。由此可见，离子液体与小檗碱分子之间结合能的数据可以很好地从分子尺度上解释微波外场强化可提高离子液体溶液提取小檗碱收率。

3 结 论

本研究采用离子液体-微波联合辅助方法，从黄连中提取小檗碱，实现提取的高效过程强化。主要结论如下。

(1)所选用的五种咪唑类离子液体中，[OMIM]Ac提取效果明显优于其他离子液体。使用微波外场加热方式获得的小檗碱提取收率明显优于常规加热方式。且离子液体的加入可以实现小檗碱提取收率的进一步提升。离子液体和微波作为重要的辅助方法可以实现提取的强化传质，达到小檗碱提取收率提升的效果。

(2)通过离子液体-微波辅助提取黄连中小檗碱实验，对于0.5 mol/L的[OMIM]Ac离子液体溶液获得最佳工艺条件为：黄连-离子液体溶液固液比1∶70；溶液pH=4,微波时间8 min,提取温度60℃,微波功率300 W,在此条件下，盐酸小檗碱的提取收率最高可达到58.9 mg/g。

(3)通过第一性原理的分子模拟对离子液体与小檗碱分子间相互作用进行了直观刻画和定量研究。RDG 分析结果表明离子液体与小檗碱之间的作用力主要是弱相互作用，表现为范德华力。离子液体与小檗碱分子间相互作用的结合能数据可以很好地从分子尺度上解释微波外场强化可提高离子液体溶液对小檗碱的提取收率。