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温室大棚土壤生物修复剂的菌种选育及应用效果

2020-07-20田连生

江苏农业科学 2020年12期
关键词:温室大棚木霉多菌灵

摘要:采用紫外线诱导和化学诱变相结合的方法,对生防木霉T11菌株进行选育得到T11-5-2变异菌株。该菌株在多菌灵浓度为100 mg/L的无机盐培养基中,于25 ℃,200 r/min条件下振荡培养,用HPLC-MS检测显示,处理 2 d 的培养液中检测出多菌灵和3种代谢产物;处理5 d的培养液经检测未发现多菌灵和代谢产物;以玉米秸秆为原料,在温度为 25 ℃ 条件下固体发酵6 d,制成生物修复剂。该修复剂可有效降解5种常用农药,并对黄瓜灰霉病的活体防治效果达到79.5%,优于化学农药多菌灵。

关键词:温室大棚;木霉;生物修复;代谢物;多菌灵

由于温室大棚的不易迁移和常年重茬种植同一种作物,土壤中大量土传病原菌滋生繁殖,易引发植物病害。而病害的频繁发生,又促使农民用药次数增加,致使土壤中农药残留升高,形成恶性循环,导致棚内土壤生态平衡受到严重破坏。笔者对蔬菜大棚内土壤采用多点采样进行检测分析,然后与同一地未建大棚的耕地土壤检测数据比较,发现棚内土壤中的农药残留量是非大棚耕地的3.6倍,而细菌、放线菌、霉菌等微生物种群却减少4~6倍。可见,化学农药的大量、重复使用,使土壤中的农药残留量大幅增加,不仅使生产的农产品残留超标,而且还破坏了土壤的微生态平衡,导致微生物数量大幅减少。随着人们生活水平的提高,对食品安全和环境安全也提出了更高要求。无药物残留、无副作用的绿色农副产品越发受到人们青睐。因此,对温室大棚内的土壤进行生物修复意义重大。目前,国内外对多菌灵降解菌的研究多集中于细菌,且均为液体降解研究[1-9]。

木霉(Trichoderma sp.)T11菌株,是笔者所在实验室分离出的高效生防真菌菌株,对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、镰刀菌(Fasarium spp.)等多种土传病原菌具有良好的抑制作用;通過药物驯化、紫外线诱导和化学诱导相结合的方法,对筛选出的生防木霉T11菌株进行改良,得到T11-5-2木霉变异菌株。使其在保持对多种病原菌有良好拮抗性的同时,对速克灵、多菌灵等化学农药残留有显著的降解效果,可使生产的蔬菜等农产品有害残留量大幅降低,达到绿色食品标准。农药残留被降解为二氧化碳和水,对环境不会造成二次污染,同时,还可以防治农作物灰霉病、枯萎病、霜霉病等常见和多发病害,使土壤修复、农药残留降解和土传病害的防治有机结合,从而大幅提高劳动生产效率、降低成本,有效提高大棚蔬菜的经济效益,有较高的应用前景和推广价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料主要有木霉(Trichoderma sp.)T11降解菌株,由笔者所在实验室在农药厂土壤中分离、选育得到;50%多菌灵可湿性粉剂,由江苏靖江农药厂提供;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:200 g马铃薯,20 g葡萄糖,15 g琼脂,1 000 mL水,pH值自然;PDA药物培养基:把PDA培养基熔化后,加入一定量多菌灵粉剂混合均匀后倒入平板制得;无机盐培养基:5.710 g K2HPO4,1.700 g KH2PO4,2.630 g(NH4)2SO4,0.095 g MgSO4·7H2O,0.050 g MnSO4,0.05 g FeSO4,0.003 g CaCl2,1 000 mL 水,pH值为7.0;甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,简称EMS),由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.2 紫外线多重诱导及药物驯化处理

在接种木霉菌株T11于25 ℃恒温培养5 d的PDA培养基平板上,加入50 mL无菌水,轻轻洗刷绿色分生孢子,制成107个/mL孢子悬浮液。在含多菌灵 10 mg/L 的PDA药物培养基上涂抹0.1 mL上述孢子悬浮液。去盖在20 W、波长为253.7 nm的紫外灯管下30 cm处,避光照射后立即用黑纸包好,放入25 ℃恒温箱中培养。每次照射时间为 60 min。每个处理重复3次。统计平板上菌落数并将其转接到含10 mg/L多菌灵的PDA药物培养基上。选取生长迅速的变异木霉菌株,待产生大量绿色分生孢子后,再按上述方法配制孢子悬浮液,涂抹在含 20 mg/L 多菌灵PDA药物培养基上,进行第2次紫外线重复诱导和驯化处理。依此类推,逐步提高多菌灵浓度达到1 500 mg/L,获降解性变异菌株T11-5。

1.3 化学诱导处理

在接种木霉菌株T11-5于25 ℃恒温培养5 d的PDA培养基平板上,刮取少量绿色分生孢子,用无菌生理盐水和0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH值为5.0)各洗涤1~2次后,将洗好的T11-5菌株分生孢子悬浮于含有10 g/L甲基磺酸乙酯的磷酸钾溶液(pH值=5.0)中,25 ℃振荡处理1~2 h。取 10 mL 处理后的悬液用0.16 mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应,离心收集孢子,用无菌生理盐水洗涤后,加入无菌水,制成107个/mL孢子悬浮液,取0.1 mL上述孢子悬浮液均匀涂在PDA培养基平板上,于25 ℃恒温培养,从平板上挑取菌落较大的进行纯化。最后得到能在多菌灵浓度达到 2 000 mg/L 的PDA平板上良好生长的变异菌株T11-5-2。

1.4 菌株T11-5-2对多菌灵降解

在无机盐培养基中加入100 mg/L多菌灵,以5%接种量接入木霉T11-5-2种子液,于25 ℃、200 r/min 振荡培养。2、5 d后分别取样1次,用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)检测培养液中多菌灵及代谢产物含量[10]。

1.5 对其他几种常用农药的降解

在pH值为6.0的无机盐培养基中分别加入100 mg/L多菌灵、速克灵、扑海因、甲基托布津、三唑酮,以5%接种量接入种子液,于25 ℃、200 r/min 条件下振荡培养5 d,取样分别测定各自农药的残留量[11]并计算降解率。每个处理重复3次。

1.6 制备种子液

液体培养基:8~10 mL马铃薯浸出液,0.2~0.4 g (NH4)2SO4,0.2~0.3 g K2HPO4,1 g CaCO3,补加水至1 000 mL,调节pH值至6.0~6.5。取上述培养液100 mL,高压灭菌20~30 min。冷却后接入已活化好的木霉菌T11-5-2菌株,于25~26 ℃、200 r/min振荡培养,用分光光度计测量D600 nm达到0.30~0.35 停止液体发酵。发酵液作为种子液备用。

1.7 固体发酵

固体培养基:10 g玉米秸秆粉(粉碎至30~40目),3 g麸皮,0.8~0.9 g葡萄糖,0.20~0.40 g(NH4)2SO4,0.10~0.20 g KH2PO4,0.08~0.10 g MgS04·7H2O,1 000 mL水,调节pH值至6.0~6.5。高压灭菌30 min,冷却后接入上述T11-5-2菌株种子液100~130 mL,搅拌均匀,放在25~26 ℃ 恒温培养箱中培养6 d,用血球计数板测量固体发酵物的分生孢子量达到1010 个/g,即可结束固体发酵出料,常温风干或使用真空干燥器控制温度在45 ℃左右干燥。即可得到复合生物修复剂。

1.8 生物防效试验

经过固体培养基发酵获得木霉T11-5-2菌株分生孢子粉,把孢子粉和多菌灵可湿性粉剂用无菌水稀释800倍,各取一定量药液与等量灰霉菌孢子悬浮液(孢子浓度为105个/mL)混合均匀,然后喷施在盆栽黄瓜苗上。每盆种植8株津青1号黄瓜,每株留3片复叶,用药10 mL/株。并喷施等量无菌水作空白对照。于20 ℃恒温保湿3 d,调查叶片发病情况,计算发病率和防治效果。每个处理4盆,重复3次。

发病率=感病株数/总株数×100%;  防治效果=(对照发病率-用药发病率)/对照发病率×100%。

2 结果与分析

2.1 菌株T11-5-2对多菌灵的降解试验

对处理多菌灵2 d的培养液采用HPLC-MS分析,结果出现4个峰(图1),结合相应的质谱分析认为,代谢产物A为2-氨基苯腈、B为2-氨基苯并咪唑、C为苯并咪唑、D为未降解的残留多菌灵,保留时间分别为1.42、1.81、2.42、3.14 min。而在对T11-5-2菌株处理多菌灵5 d的培养液进行HPLC-MS分析时,却未再检测出代谢产物和多菌灵残留(图2)。说明T11-5-2菌株5 d已完全降解100 mg/L的多菌灵,且经过10次继代转接后降解效果仍较稳定。

对多菌灵经过5 d处理,通过HPLC-MS分析,已经检测不到多菌灵及其降解物的存在,已经被彻底转化为成二氧化碳和水,对环境不会产生二次污染。

2.2 对其他几种常用农药的降解

由图3可知,降解菌对速克灵、多菌灵的降解率分别高达98.1%、90.4%,对扑海因、甲基托布津、三唑酮的降解率分别达到86.5%、40.1%、55.3%。表明该降解菌株对5种不同类型的化学农药均具较好的降解作用,表明T11-5-2菌株具有较广泛的降解能力,这在降解菌的研究中还未见报道过。

由于农作物病害种类繁多,施用1种农药已不能完全达到防病效果,为保证稳产、高产,往往会在田间施用多种农药,因此降解菌株能够对多种农药具有降解特性是十分必要且应用价值极高的。

2.3 生物防效试验

试验前应把盆栽黄瓜用水浇透,然后喷施各处理800倍药液。于20 ℃恒温保湿处理3 d,调查感病叶片数。

活体拮抗性试验结果(表1)表明,木霉菌对黄瓜灰霉病的防治效果可达到79.5%,优于化学农药多菌灵的防治效果(71.7%),且差异明显。这充分表明木霉T11-5-2菌株除具有良好的降解效果外,还具有优良的对土传病害防治效果。

3 结论

通过药物驯化、紫外线诱导、化学诱导相结合的方法,人工选育出木霉变异菌株T11-5-2,在多菌靈浓度为100 mg/L条件下,于25 ℃、200 r/min振荡培养5 d,可完全降解多菌灵。以玉米秸秆为主要原料,通过固体发酵6 d,制备的修复剂分生孢子数达到1.4×1010 CFU/g。木霉菌株T11-5-2对浓度为 100 mg/L 的速克灵、多菌灵、扑海因、三唑酮、甲基托布津在最适条件下处理5 d,降解率分别达到 98.1%、90.4%、86.5%、55.3%、40.1%。木霉菌对黄瓜灰霉病的防治效果可达到79.5%,优于化学农药多菌灵的防治效果(71.7%),且差异明显。

参考文献:

[1]Chiba M,Singh R P. High-performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of benomyl and carbendazim in aqueous media[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1986,34(1):108-112.

[2]许敬亮,王志春,李顺鹏,等. 多菌灵降解菌株dj-6-1的分离、鉴定及降解特性[J]. 中国环境科学,2006,26(3):307-310.

[3]Holtman M A,Kobayashi D Y. Identification of rhodococcusery thropolis isolates capable of degrading the fungicide carbendazim[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1997,47(5):578-582.

[4]程洁红,李慧蓉. 高效降解菌处理多菌灵农药生产废水的研究[J]. 上海环境科学,2003,22(10):690-694.

[5]Pattanasupong A,Nagase H,Sugimoto E,et al. Degradation of carbendazim and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by immobilized consortium on loofa sponge[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2004,98(1):28-33.

[6]Mazellier P,Leroy E,de Laat J,et al. Degradation of carbendazim by UV/H2O2 investigated by kinetic modelling[J]. Environmental Chemistry Letters,2003,1(1):68-72.

[7]Pattanasupong A,Nagase H,Inoue M,et al. Ability of a microbial consortium to remove pesticide,carbendazim and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2004,20(5):517-522.

[8]張丽珍,乔雄梧,马利平,等. 多菌灵降解菌NY97-1的鉴定及降解条件[J]. 环境科学学报,2006,26(9):1440-1444.

[9]Zhang G S,Jia X M,Ma X H,et al. Isolation,identification and phylogenetic analysis of carbendazim-degrading bacterium strain[J]. Acta Microbiologica Sinica,2004,44(4):417-421.

[10]田连生,陈 菲. 多菌灵降解菌T8-2的分离及其降解条件研究[J]. 江苏农业科学,2008(6):271-274.

[11]中国农业科学院植物保护研究所. 农药分析[M]. 8版.北京:化学工业出版社,1988.宋林韩,金 鹏,吴 桐,等. 陕北黄土高原耕地生态安全的时空格局[J]. 江苏农业科学,2020,48(12):249-257.

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