邵文豪，王兆山，张建国＊

(1.中国林业科学研究院林业研究所，国家林业和草原局林木培育重点实验室，林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091；2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400)

油橄榄（Olea europaea L.）为木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea L.）常绿乔木，是世界著名木本油料树种，主要分布于地中海地区，由其新鲜初熟或成熟果实冷榨而成的橄榄油，富含单不饱和脂肪酸和抗氧化物质，营养和保健功能越来越受到人们的认可[1-2]。

油橄榄为风䗋异花授粉，不同品种自交和杂交亲和性仍没有得到充分地研究和揭示，如对栽培品种“Moraiolo”和“Manzanillo”自交亲和性的研究，不同学者得出的结论完全相反[3]。Mekuria 等[4]认为，实验条件不同甚至参试品种鉴定不准确或名称混淆，自交亲和性的研究都有可能出现截然不同的结果。人工套袋授粉，显微观察花粉管萌发、生长，统计坐果率，是油橄榄品种亲和性研究的常规方法[5-6]，但这种方法很难避免外来花粉污染[7]，袋内微环境的改变及果实自然脱落都会影响对套袋真实坐果率的判断[8]。采用分子标记方法进行亲和性分析准确性较高，其中，SSR 标记具有共显性、高多态性的特点，在油橄榄遗传学研究中得到广泛应用[3,9-13]。

20 世纪50 年代以来，我国自国外引种油橄榄品种150 多个，在甘肃、四川、重庆、云南等地推广种植，目前栽培面积近11 万hm2，经济、生态和社会效益显著；然而，我国早期营建的很多油橄榄品种园缺乏明确的授粉品种配置技术，坐果率低、挂果少、产量低等现象较为普遍。甘肃武都油橄榄品种园是我国收集保存油橄榄种质资源较丰富的品种园，本研究以该品种园收集保存的114 份油橄榄种质作为候选父本，选择园内4 个主要栽培品种，利用SSR 标记对品种子代的真实父本进行鉴定，分析品种亲和性，探索适宜的授粉品种，以期为油橄榄品种园中品种配置提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘肃省陇南市武都地区自1978 年开始引种油橄榄，1992 年建立近7 hm2油橄榄丰产示范园[14]。目前，武都油橄榄品种园已收集、保存油橄榄种质114 份（114 份种质信息表略），包括油橄榄亚种尖叶木犀榄（O.europaea subsp.cuspidata (Wall.ex G.Don) Cif.）和变种金叶木犀榄（O.europaea subsp.cuspidata var.chrysophylla Lam.）。

品种园内不同种质材料混合种植，株行距约3 m×3 m，植株长势良好。选择“城固32”（“Chenggu 32”）、“豆果”（“Arbequina”）、“贺吉布兰克”（“Hojiblanca”）和“皮瓜尔”（“Picual”）4 个主要栽培品种，于果实成熟期分别从不同品种植株中部的4 个方位，随机采摘新鲜果实5 颗以上，其中，“城固32”30 颗，“豆果”25 颗，“贺吉布兰克”20 颗，“皮瓜尔”20 颗。用自封袋将果实分装带回实验室，果肉自然软化后，去除果皮，剥出的种子保存在4℃冰箱中备用。

从每份种质的正常结实植株上采集新鲜叶片，立即装在样品袋中进行硅胶干燥，带回实验室于4℃冰箱中储藏备用。样品采集时，详细登记每份种质的原始名称、原产地和引种地等信息。原始记录名称缺失或不确定的27 份种质，采用UC1、UC2、UC3、 ···、UC27 进行编号。

材料标本凭证保存于中国林业科学研究院林业研究所国家林业和草原局林木培育重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 叶片DNA 提取：利用天根生化科技（北京）有限公司生产的植物基因组DNA 提取试剂盒（DP305）提取油橄榄叶片全基因组DNA，操作参照说明书。

种胚DNA 提取：使用同款DNA 提取试剂盒，按照产品说明向GP1 缓冲液中加入定量的β-巯基乙醇，65℃水浴备用。将油橄榄种子从硬质内果皮中剥离出，浸泡于65℃水中，去除种皮和胚乳，切取1/2 种胚置于1.5 mL 离心管中，加入约300 μL 备用GP1 缓冲液，利用TIANGENOSEY30 高速组织研磨器研磨至样品完全粉碎，再向研磨样品加入备用GP1 缓冲液约400 μL，轻摇混匀，置于65℃水浴锅中水浴40～60 min，期间每10 min 取出重新混匀，后续操作参照说明书。

1.2.2 引物合成 14 对SSR 引物根据文献[15-19]中记载的序列信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供合成服务，其中，5′端分别用6-FAM、HEX、TMR 和ROX 荧光进行标记（表1）。

1.2.3 PCR 扩增测序 PCR 扩增采用20 μL 反应体系，包括7.9 μL ddH2O，10 μL PCR Mix（含DNA polymerase、dNTPs 和Buffer），正反向引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，以 及0.5 ng 模 板DNA。扩增程序：94℃预变性，4 min；94℃变性30 s，60℃左右退火30 s，72℃延伸2 min，10 个循环；94℃变性30 s，55℃左右退火30 s，72℃延伸2 min，26 个循环；72℃延伸10 min；10℃保存。退火温度因引物不同而异。使用ABI Veriti96 PCR 仪进行PCR 扩增，产物送北京擎科新业有限公司进行Sanger 法测序。

1.2.4 数据处理 采用GeneMapper 4.0 软件（Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom），按照使用说明书，设置参数，进行基因分型。分型的结果以Excel 表格输出。

建立母本、候选父本（叶片）和子代（种胚）基因型数据库，使用Cervus 3.0 软件计算等位基因频率、期望杂合度、观测杂合度、多态信息含量、哑等位基因以及非父排除概率等参数[20-21]。运行Simulation 程序中的paternity 子程序，输入等位基因频率分析文件，模拟10 000 次亲子鉴定。运行Parentage Analysis 程序中的paternity 子程序，输入子代及候选父本基因型文件、等位基因频率分析和模拟分析文件，计算候选父本基因型似然对数比（LOD）值和不同置信水平（80%和95%）Delta值（最大和次大LOD 值的差值），根据LOD 值大小判定亲子关系。

2 结果与分析

2.1 油橄榄品种种子发育及种胚获取

4 个油橄榄品种共采集果实95 颗，种子败育现象在品种间普遍存在，“豆果”种子发育正常果实比例最高（96%），“贺吉布兰克”最低（70%）（表2）。

表1 14 对SSR 引物序列信息Table 1 Sequence information of the 14 SSR markers

油橄榄种子发育过程中，2 个心皮内分别着生2 个胚珠[22]，后期通常只有1 个胚珠发育成为种子[23]。通过对不同品种种子解剖发现，“城固32”和“贺吉布兰克”果实内具有2 粒发育正常种子的现象（图1），其中,“贺吉布兰克”果实具2 粒发育正常种子的比例达25%（表2）。

4 个品种共获得88 粒发育正常的种子，具2 粒发育正常种子的仅取其中1 粒，共剥离出80 个种胚用于父本鉴定分析。

2.2 父本鉴定参数检测

2.2.1 等位基因频率 14 个SSR 位点的平均等位基因数16.1 个（表3），其中，DCA9 位点上的等位基因数目最多（29 个），GAPU59 位点上等位基因数目最少（8 个），均满足利用SSR 标记进行父本分析所需等位基因数要求[24]。UDO99-019 位点132 bp 的等位基因频率最高（0.645 9），而GAPU101 位点194、216、245 和247 bp 的等位基因频率最低，均为0.002 6。

2.2.2 平均杂合度 14 个SSR 位点的观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）均值分别为0.788 0和0.786 3，变异范围分别为0.514 0～0.995 0 和0.551 0～0.926 0（表4）。Ho 和He 均值相近，表明油橄榄品种受选择及近交等因素的影响较小；平均杂合度较高，表明油橄榄品种遗传变异大，环境适应能力强。

表2 油橄榄不同品种果实种子发育情况Table 2 Seed development of different olive cultivars

图1 油橄榄不同品种种子发育比较Fig.1 Comparison of seed development between different olive cultivars

2.2.3 多态信息含量及排除概率 通常认为，多态信息含量（PIC）＞0.500 0 时位点为高度多态，0.250 0＜PIC＜0.500 0 时位点为中度多态，PIC＜0.250 0 时则为低度多态位点[25]。14 个SSR 位点的PIC 值均大于0.500 0（表4），均为高度多态位点。平均多态信息含量为0.758 8，其中，UDO99-019 位点最低（0.520 0），GAPU103 位点最高（0.918 0）。14 个SSR 位点具有丰富的多态性，能够为研究提供足够的多态信息。

当双亲基因型皆未知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-1P）变化范围为0.268～0.827，均值0.550；当一个亲本基因型已知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-2P）变化范围为0.155～0.664，均值0.387；当双亲基因型已知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-PP）变化范围为0.040～0.504，均值0.212（表5）。

依据PIC 值由高至低依次累积计算14 个SSR 位点的排除概率，随着SSR 位点数增加，累积排除概率增大（图2）。对于单亲已知类NE-2P，基于前9 个SSR 位点累积排除概率0.958，基于前12 个SSR 位点累积排除概率0.994，而基于全部14 个SSR 位点累积排除概率高达0.999。

2.2.4 哑等位基因频率 哑等位基因影响遗传分析结果，数据处理时需要将哑等位基因频率偏高的位点删除[26]。对14 个SSR 位点哑等位基因的检测结果表明，各位点均存在一定的哑等位基因，但频率较低，均小于0.080 0（表4），可用于亲本鉴定分析[26]。

2.3 父本鉴定

在置信度80%水平，4 个品种共计29 个子代鉴定出候选父本（表6），其中“城固32”13 个（鉴定率50%），“豆果”7 个（鉴定率29%），“贺吉布兰克”5 个（鉴定率36%），“皮瓜尔”4 个（鉴定率25%）。

在置信度95%水平，“城固32”、“豆果”和“皮瓜尔”子代主要候选父本分别为“豆果”（占60%）、“小苹果”（占67%）以及“豆果”（占100%），而“贺吉布兰克”子代鉴定出的候选父本仅1 个，为“小苹果·塞维利亚”。

表5 14 个SSR 位点的非父排除概率Table 5 Non-exclusion probability of the 14 SSR loci

图2 14 个SSR 位点的累积排除概率Fig.2 Combined exclusion probability of the 14 SSR loci

3 讨论

多态信息含量（PIC）是衡量基因丰富度的重要指标，等位基因越多，多态性越丰富。本研究中,14 个SSR 位点PIC 均值0.758 8，多态性高，哑等位基因频率检测结果也表明各SSR 位点可用于油橄榄品种子代的父本分析。基于遗传排除法（Genetic exclusion）[27]和Cervus 3.0 软件[28-30]，利用这14 个SSR 标记对我国甘肃武都油橄榄品种园“城固32”、“豆果”、“贺吉布兰克”以及“皮瓜尔”4 个主要栽培品种子代进行父本分析，检测各子代与候选父本之间的亲缘关系，在单亲基因型已知下，累积排除概率高达99%，可认为候选父本和子代间的亲子关系成立。通过比较子代、母本和候选父本的基因型，计算每个候选父本的LOD 值，从候选父本中为部分子代鉴定出真实亲本。

对油橄榄4 个品种80 个子代父本分析结果表明，在80%置信水平可为29 个子代确定候选父本，即花粉来源，鉴定率与其他学者对油松（Pinus tabulaeformis Carr.）[31]、马 尾 松（P.massoniana Lamb.）[32]、青冈（Cyclobalanopsis glauca (Thunb.)Oerst.）[33]等树种的研究结果相似。

4 个油橄榄品种的子代检测出的候选父本相对集中，共14 个品种，仅占全部候选父本的12%，表明品种园内仅有少数品种的花粉对子代的贡献较大。何田华等[34]认为,利用排除法进行亲本分析时，群体中候选亲本数量不宜大于100，否则很难为大多数子代确定亲本来源。本研究中,候选父本多达114 个，这可能是只有少部分子代的父本被鉴定出的原因之一，而不同品种间的花期同步性、品种园内小区块的品种配置等因素可能也会影响对子代花粉来源的分析和鉴定，需要在今后研究中予以关注。

油橄榄多数品种存在自交不亲和现象[4]，对品种自交亲和性和品种间杂交亲和性的研究结果受环境条件等因素的影响[35]。本研究中，4 个油橄榄品种仅在“城固32”子代中检测到来自品种自身的花粉，表明“城固32”具有自交亲和性，王笑山等[36]对陕西城固油橄榄园主要品种自花授粉坐果率的研究也表明“城固32”具有一定的自交结实能力。“豆果”、“贺吉布兰克”和“皮瓜尔”子代没有检测到品种自身花粉，为自交不亲和品种。其它学者对我国四川凉山州[13]、意大利西西里岛[35,37]油橄榄品种亲和性的研究结果也表明“豆果”自交不亲和。

“城固32”子代候选父本60%为“豆果”（置信度95%），表明“豆果”是其主要的花粉贡献品种。同时，在“豆果”子代候选父本中检测出“城固32”（置信度95%），表明这2 个品种可互相作为授粉品种，这与对四川凉山州油橄榄品种适配性的研究结果一致[13]。此外，在“豆果”和“贺吉布兰克”的子代候选父本中，“小苹果”的比例分别为57%和40%（置信度80%及95%），表明可以将“小苹果”作为“豆果”和“贺吉布兰克”建园的共同授粉品种。另外，“贺吉布兰克”子代候选父本中检测出油橄榄变种金叶木犀榄（置信度80%），表明以金叶木犀榄为父本，对“贺吉布兰克”实施杂交制种和遗传改良具有可行性。

表6 油橄榄4 个品种子代父本分析结果Table 6 Paternity analysis result of the four olive cultivars progenies

研究发现“城固32”和“贺吉布兰克”果实内具有2 粒发育正常的种子，且在后者果实中的比例达25%，而“豆果”和“皮瓜尔”果实内仅有1 粒发育正常的种子。Cuevas 等[23]研究表明，“贺吉布兰克”果实（14%）中同样具有2 粒发育正常的种子，“皮瓜尔”中没有此现象，但在“豆果”中发现了少量果实（4%）具2 粒发育正常的种子。Farinelli等[37]研究表明，在一些油橄榄品种中，具2 粒发育正常种子的果实比仅2 粒种子的果实大。因此，今后应加强对果实具2 粒发育正常种子品种的研究，比较具2 粒种子与1 粒种子果实的表型差异，通过父本分析确定花粉来源，继而探索授粉品种对油橄榄果实种子发育的影响。

4 结论

本研究将我国甘肃武都油橄榄品种园114 份种质作为候选父本，利用14 个SSR 标记对园内4 个主要栽培品种“城固32”、“豆果”、“贺吉布兰克”和“皮瓜尔”的子代进行父本分析，结果表明14 个SSR 位点均为高多态性位点，对于单亲已知类NE-2P，其累积排除概率高达0.999，这为油橄榄品种子代父本鉴定提供了重要的遗传标记选择。经检测，“城固32”和“皮瓜尔”子代的主要父本为“豆果”，而“豆果”和“贺吉布兰克”子代的主要父本为“小苹果”，同时，4 个品种仅“城固32”具有一定的自交亲和性，这为今后油橄榄建园时的品种配置设计提供了基础依据。