缪 楠,秦倩倩,周 颖,吴琼英,贾俊强

(1.江苏科技大学 生物技术学院, 镇江 212018) (2.江苏科技大学 粮食学院, 镇江 212004)

胶原蛋白是生物体中最主要的结构蛋白,对机体细胞的迁移、分化、繁殖以及机体组织的形成和功能发挥等均有重要作用.胶原蛋白类型繁多,主要存在于动物的皮、骨和肌腱等结缔组织中[1].其中,I型胶原蛋白具有较弱的抗原性和良好的生物相溶性及生物降解特性，被广泛用于食品、化妆品、生物医学材料、组织工程等领域[2].目前，胶原蛋白制品主要来源于陆生动物,但由于疯牛病和口蹄疫等流行病的发生,人们逐渐将胶原蛋白的来源转向水生及两栖类生物[3].与陆生动物胶原蛋白相比,鱼类胶原蛋白的热稳定性和生物力学性能较差[4],限制了鱼类胶原蛋白的进一步利用.自组装能使胶原分子单体通过大量非共价键弱相互作用力的协同效应进行有序排列,形成具有交错条纹结构的胶原纤维,从而改善胶原纤维的生物力学性能[5].

鲫鱼(Carassiusauratus)又名喜头,属硬骨鱼纲,鲤形目,鲤科,鲫属,为我国主要养殖的淡水鱼之一.现代研究表明,鱼皮作为水产加工中的副产物,其胶原蛋白含量占总蛋白含量的80%以上[6],是一种潜在的胶原蛋白资源.与其他淡水鱼相比,鲫鱼具有价格低廉、体内胶原蛋白含量丰富等优点[7],因此具有良好的开发前景.文中以鲫鱼皮为原料,分别利用酸法和酶法制备酸溶性和酶溶性胶原蛋白,对胶原蛋白的氨基酸组成、分子量、紫外光谱、二级结构以及自组装行为进行了初步研究,以期为鲫鱼皮胶原蛋白的进一步开发提供理论依据.

1 实验

1.1 材料与试剂

新鲜鲫鱼购于镇江市万达广场苏果超市.在仔细分离鱼鳞后，将鱼皮从鱼肉上剥离,去除鱼皮上的残余鱼肉.随后将鱼皮分次充分洗涤后切成0.5 cm×0.5 cm左右小片,淋干后-20 ℃冻藏.NaOH、NaCl、乙酸等化学试剂均为国药分析纯;胃蛋白酶(3 000 U/mg)购于上海源叶生物科技有限公司;蛋白Marker(170kDa)购于Thermo Fisher公司;考马斯亮蓝R-250购于北京索莱宝科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 胶原蛋白的提取

胶原蛋白提取法主要有酸溶法和酶溶法．文中胶原蛋白的提取参考文献[8]的方法并略作改动.首先对化冻后脱脂、除杂蛋白的鱼皮进行乙酸浸提，得到酸溶性胶原蛋白，继续对不可溶的残渣进行胃蛋白酶酶解，得到酶溶性胶原蛋白．

酸溶性胶原蛋白:蒸馏水洗涤鱼皮至洗涤液无味后用0.5 mol/L的乙酸溶液于4 ℃下浸提48 h,浸提期间不间断搅拌，5 000 r/min转速下离心30 min,收集上清液.添加NaCl至终浓度0.9 mol/L,收集酸溶性胶原蛋白,0.5 mol/L乙酸复溶,0.01 mol/L乙酸透析备用.

酶溶性胶原蛋白:将上述离心后得到的沉淀用清水漂洗至漂洗液中性,用含有 0.5%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸4 ℃浸提沉淀48 h,浸提期间不间断搅拌，5 000 r/min转速下离心30 min,收集上清液.添加NaCl至终浓度0.9 mol/L,收集酶溶性胶原蛋白,0.5 mol/L乙酸复溶,0.01 mol/L乙酸透析备用.

1.2.2 氨基酸测定

称取15.2 mg胶原蛋白样品,用7 mL浓度为6 mol/L的HCl溶解,N2保护,110 ℃酸水解22 h,冷却后转移至10 mL容量瓶,定容.取0.2 mL酸水解后的样品用55 ℃N2吹干,加入1 mL蒸馏水再烘干,反复3次.用1.2 mL以去离子水配制的0.02 mol/L HCl充分溶解,混匀.用 0.45 μm滤膜过滤,进样20 μL,使用L-8900氨基酸分析仪(日本日立公司)测试.

1.2.3 SDS-PAGE

采用8%分离胶,5%浓缩胶的SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色，用冰醋酸-乙醇为脱色液进行脱色.

1.2.4 紫外光谱测定

准确称取2 mg胶原蛋白样品溶于2 mL 0.01 mol/L乙酸中,离心后取上清液在190～400 nm波长下进行紫外扫描.

1.2.5 近红外拉曼光谱测定

准确称取酶溶性和酸溶性胶原蛋白样品各2 mg,置于QE65Pro型拉曼光谱仪下进行扫描,激发波长785 nm,采样积分时间10 s,平均扫描3次,扫描范围0～2 700 cm-1.使用OPUS5.5软件进行光谱拟合.

1.2.6 胶原蛋白自组装行为观察

自组装方法参考文献[9]并略作改动,以鱼皮酸溶性、酶溶性胶原蛋白溶液为研究对象,自组装前保持酸溶性、酶溶性胶原蛋白溶液处于冰浴中.构建2 mL自组装反应体系,初始参数为:NaCl浓度200 mmol/L,pH 7.21,胶原蛋白浓度1 mg/mL,将反应液混合均匀后立即置于20 ℃水浴中进行自组装,每隔30 s在紫外波长313 nm下测定吸光度,自组装时间1 h.以自组装时间为横坐标,吸光度为纵坐标绘制自组装曲线.

1.2.7 不同因素对鲫鱼皮胶原蛋白自组装行为的影响

以鱼皮酸溶性、酶溶性胶原蛋白为研究对象,分别研究胶原蛋白质量浓度、pH、NaCl浓度和温度对自组装行为的影响．

(1) 胶原蛋白质量浓度对自组装行为的影响

在其他因素(pH、NaCl浓度、温度)不变的情况下,研究胶原蛋白质量浓度(0.1、0.3、0.5、1、2.1 mg/mL,其中酶溶性胶原蛋白浓度将2.1 mg/mL改为1.3mg/mL)对自组装行为的影响,分别绘制自组装动力学曲线.

(2) pH对自组装行为的影响

在其他因素(胶原蛋白质量浓度、NaCl浓度、温度)不变的情况下,研究pH(4.1、6.8、7.2、9.6)对自组装行为的影响,分别绘制自组装动力学曲线.

(3) NaCl浓度对自组装行为的影响

在其他因素(胶原蛋白质量浓度、pH、温度)不变的情况下,研究NaCl浓度(0、60、120、200、400、600、800 mmol/L)对自组装行为的影响,分别绘制自组装动力学曲线.

(4) 温度对自组装行为的影响

在其他因素(胶原蛋白质量浓度、pH、NaCl浓度)不变的情况下,研究温度(10、20、35、50、70 ℃)对自组装行为的影响,分别绘制自组装动力学曲线.

1.2.8 自组装过程中微观结构观察

根据自组装曲线,分别选取鱼皮酸溶性和酶溶性胶原蛋白自组装过程中成核期、快速成长期和平衡期的自组装材料，置于-55 ℃的冷井中快速冷冻20 min.使用CM1520型冰冻切片机将冷冻后的自组装材料进行切片,切片厚度10 μm,将切片置于载玻片上,常温下阴干样品中水分.利用考马斯亮蓝R-250组织染色法对不同阶段的自组装材料染色,染色时间3 min,5%乙醇溶液脱色5 min.常温阴干后置于E100型光学显微镜下进行微观结构观察.

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 鲫鱼皮胶原蛋白的提取

使用1.2.1方法提取的酸溶性胶原蛋白、酶溶性胶原蛋白经真空冷冻干燥后皆为白色细孔海绵状结构,蓬松质软且不分散.样品中蛋白产量分别为(38.32±0.61)%和(13.81±0.32)%.鲫鱼皮胶原蛋白提取率远高于同类文献中猪皮的提取率[10],说明鱼皮胶原蛋白更易溶于乙酸溶液中.这可能是由于鱼皮胶原蛋白的高级空间结构与排列相较于哺乳动物而言更疏松,有利于胶原蛋白自组装动力学的研究.

2.2 氨基酸分析

由氨基酸组成(表1)分析表明,酸溶性、酶溶性胶原蛋白的氨基酸组成基本差异不明显,主要氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和特征性的羟脯氨酸.其中甘氨酸约占氨基酸总量的33%,且脯氨酸含量较高,未检测出色氨酸,符合I型胶原蛋白氨基酸比例及其经典三肽Gly-X-Y结构[1,11](X多为脯氨酸,Y多为羟脯氨酸).

表1 鲫鱼皮胶原蛋白样品中氨基酸组成分析Table 1 Amino acid composition of collagens

注:N表示此氨基酸含量极低,未能检测出.

2.3 SDS-PAGE分析

酸溶性、酶溶性胶原蛋白样品的SDS-PAGE凝胶电泳图谱(图1)结果表明:(1) 两种胶原蛋白皆由α1、α2两条约120kDa左右的轻链和一条约200kDa左右的β重链组成,α1含量约为α2的两倍,符合典型Ⅰ型胶原蛋白结构特征,与胶原蛋白肽链氨基酸残基数1014基本相符;(2) 两种样品条带分布基本一致.鲫鱼皮胶原蛋白与哺乳动物胶原蛋白最小单位分子量一致,可能具有相似或相同的蛋白高级结构[11].

1：酶溶性胶原蛋白;2：酸溶性胶原蛋白;3：蛋白Marker图1 鲫鱼皮胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE of collagens fromCarassiusauratus skin

2.4 紫外光谱分析

胶原蛋白中芳香烃类氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸含量较低且不含色氨酸,其主要生色基团集中在羰基、羧基和肽键上.紫外光谱分析(图2)结果表明，两种胶原蛋白紫外主要吸收在215～220 nm区间,酶溶性、酸溶性胶原蛋白在218 nm附近具有强烈吸收.文献[12]结果表明，鳕鱼皮胶原蛋白在220 nm处具有强烈的吸收.文献[13]结果表明，鲤鱼皮胶原蛋白在233 nm处具有特征性吸收峰.这可能是由于鲢鱼皮胶原蛋白结构更紧密,其内基团氢键作用更强烈引起的光谱蓝移.从图2可知,酸溶性、酶溶性胶原蛋白在280 nm处皆有较弱的吸收峰,说明两种胶原蛋白都含有少量的芳香族氨基酸[14].

图2 鲫鱼皮胶原蛋白的紫外光谱图Fig.2 UV spectrum of collagens fromCarassiusauratus skin

2.5 二级结构分析

荧光干扰使胶原蛋白的拉曼信号偏弱,根据文献[15]的方法,对原始拉曼光谱进行归一化处理(利用1 004 cm-1下苯丙氨酸的吸收峰进行归一化处理)，得到图3.其中,酰胺Ⅰ带(1 610～1 700 cm-1)包含蛋白二级结构信息且较为常用,在1 665 cm-1获得明显的特征峰,这与文献[16]的结果类似.对1 610～1 700 cm-1的处理光谱进行子峰拟合，得到图4.利用拟合子峰计算各二级结构百分比，结果见表2.根据表2可以得出以下结论:(1) β-折叠是胶原蛋白的经典构成之一,而干样中α-螺旋含量较低,这可能是由于高含量β-折叠可以使得宏观力学结构更为稳固；(2) 酶溶性胶原蛋白的β-折叠含量略高于酸溶性胶原蛋白,这可能是由于其含有更高的甘氨酸所致,甘氨酸羰基氧与脯氨酸的酰胺氢可以形成稳固的氢键,因此高含量的甘氨酸能稳定三螺旋结构.拉曼光谱分析表明,鲫鱼皮胶原蛋白与其他哺乳动物胶原蛋白具有相类似的二级结构[16],但鲫鱼皮胶原结构更为疏松,相较于哺乳动物源胶原更易被利用于水介导的自组装.

图3 归一化后鲫鱼皮胶原蛋白的拉曼光谱Fig.3 Normalized Raman spectrums of collagens fromCarassiusauratus skin

图4 鲫鱼皮胶原蛋白的拉曼拟合光谱Fig.4 Fitted Raman Spectrum of the collagensfrom Carassiusauratus skin

表2 鲫鱼皮胶原蛋白各二级结构含量Table 2 Different secondary structure contents of the collagens from Carassiusauratus skin

注1:不同的小写字母代表差异显著(P<0.05).

注2:4 种二级结构的划归区间:1 645～1 660 cm-1为α-螺旋,1 660～1 670 cm-1为无规卷曲,1 665～1 680 cm-1为β-折叠,1 640～1 645 cm-1和1 680～1 700 cm-1为β-转角.

2.6 不同因素对胶原蛋白体外自组装行为的影响

2.6.1 胶原蛋白质量浓度对胶原蛋白自组装行为的影响

胶原蛋白浓度对自组装启动具有极其重要的作用.从图5(a)可以看出,酸溶性胶原蛋白自0.5 mg/mL起,自组装效果比较明显.根据快速生长期斜率可以发现,胶原蛋白浓度越高,自组装越快.另外,0.2 mg/mL以下胶原蛋白的自组装效果较差，说明自组装成核需要一定浓度的胶原蛋白才能启动自组装,这与文献[12]研究结果一致.在相同胶原蛋白浓度下,酶溶性胶原蛋白相较于酸溶性胶原蛋白自组装更快,成核期更短,平衡期在313 nm下的吸光值较低,说明酸溶性胶原蛋白形成的三螺旋结构含量更高.从图5(b)可以看出,酶溶性胶原蛋白胶原浓度自0.2 mg/mL起,自组装效果比较明显，且胶原蛋白浓度越高,自组装越快,这与酸溶性胶原蛋白自组装动力学实验结果一致.结果表明,胶原蛋白浓度对自组装成核期有决定性作用,酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白的自组装基本单位结构上略有不同.

图5 胶原蛋白浓度对鲫鱼皮胶原蛋白自组装行为的影响Fig.5 Effect of the collagen concentration on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

2.6.2 pH对胶原蛋白自组装行为的影响

图6为不同pH对酸溶性、碱溶性胶原蛋白的自组装行为的影响.图6(a)为不同pH条件下酸溶性胶原蛋白的自组装行为.pH=4.06时,酸溶性胶原蛋白自组装效果较弱且无明显S型曲线,结合pH=6.83下成核期较长的现象,说明较高浓度的乙酸对自组装有抑制作用,这可能是由于游离羧基与胶原蛋白的疏水基团竞争结合位点引起的.pH=7.21时自组装速率最高,可能是此pH与酸溶性胶原蛋白的等电点相近,反应体系内净电荷趋于零,胶原分子之间的静电电荷排斥减少,更利于自组装.而在pH=9.62时,自组装基本没有发生,这可能由于酸溶性胶原蛋白在强碱性条件下会发生高级结构消失以及一定程度的降解.综上所述,酸溶性鲫鱼皮胶原蛋白在弱碱性条件下有最优的自组装效果.

图6 pH值对鲫鱼皮胶原蛋白自组装行为的影响Fig.6 Effect of the pH value on self-assembly behaviorof collagens from Carassiusauratus skin

图6(b)为不同pH下酶溶性胶原蛋白的自组装行为.在pH=4.06时,酶溶性胶原蛋白自组装行为表现与酸溶性胶原蛋白基本一致,说明一定浓度的乙酸对两种胶原蛋白自组装皆有一定抑制作用.pH=6.83和pH=7.21时，酶溶性胶原蛋白除却自组装速率较高外,相较于酸溶性胶原蛋白,两种胶原蛋白自组装曲线皆有较明显S型.而酶溶性胶原蛋白在pH=9.62时依然有一定程度的自组装,这可能是因为酶溶性胶原蛋白的等电点比酸溶性胶原蛋白略高,因此在较高pH条件下依然可以进行自组装.

2.6.3 NaCl浓度对胶原蛋白自组装行为的影响

NaCl浓度对胶原蛋白自组装行为具有一定的提升和加速作用(图7).图7(a)表明无NaCl影响下,酸溶性胶原蛋白依然有一定的自组装行为,这可能是弱碱性条件下胶原蛋白分子本身的自聚集现象.根据图7(a)的自组装曲线可知,自60 mmol/L开始,酸溶性胶原蛋白有较明显的自组装行为,浓度为200 mmol/L时胶原蛋白自组装程度开始达到饱和.继续提高NaCl浓度并不会提高酸溶性胶原蛋白自组装的饱和度,但是会延长成核期,且对快速生长期的组装速率没有显著影响.这可能是由于较高浓度的NaCl对胶原蛋白三螺旋结构有一定解链作用并使反应体系再次达到某种稳态后纤维才会快速聚合.当NaCl浓度达到800 mmol/L时,酸溶性胶原蛋白不发生自组装行为,说明高浓度盐会使三螺旋结构不可逆性解链,使得自组装行为不会发生.

图7 NaCl浓度对鲫鱼皮胶原蛋白自组装行为的影响Fig.7 Effect of the NaCl concentration on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

图7(a)和图7(b)表明，NaCl浓度对两种胶原自组装影响基本一致,而酶溶性胶原蛋白自组装速率在相同NaCl浓度下远高于酸溶性胶原蛋白,且在600 mmol/L浓度下不进行自组装,说明酶溶性胶原蛋白基本组装单位结构更小,所需解链的NaCl浓度相较酸溶性胶原蛋白而言更低.

2.6.4 环境温度对胶原蛋白自组装行为的影响

图8(a)的结果表明，酸溶性胶原蛋白即使在10 ℃下依然且有较好的自组装行为，当温度达到20 ℃时,自组装效果最佳,而35 ℃下自组装程度则略低于前者,说明有部分胶原蛋白未能参与自组装,由此可猜测酸溶性胶原蛋白热变性温度略低于35 ℃.从50 ℃开始酸溶性胶原蛋白发生完全变性,不能进行正常自组装,其成核期一段吸光度的上升是由于传热不均导致的.图8(b)的结果表明，20 ℃下酶溶性胶原蛋白自组装达到最优效果,其热变性温度与酸溶性胶原蛋白相似,且当环境温度达到50 ℃以上时,酶溶性胶原蛋白也不能进行自组装.

图8 温度对鲫鱼皮胶原蛋白自组装行为的影响Fig.8 Effect of the temperature on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

2.7 微观结构

对胶原蛋白及其自组装材料进行微观结构观察，通常以扫描电镜法、透射电镜法、原子力显微镜法以及X衍射法等居多.用这类方法获得的胶原蛋白纤维的微观结构清楚、精细,其精度能观察到纤维的D周期[17].然而实验成本较高,对解决大量样本的微观状态或自组装材料低分辨率微观状态等问题有大材小用之嫌.文中通过简化考马斯亮蓝R-250组织染色法对胶原蛋白不同时期的自组装材料进行冷冻切片后染色处理并置于光学显微镜400倍下观察.从图9可看出,成核期内酶溶性胶原蛋白的胶原纤维相较于酸溶性胶原蛋白更长,且在同等条件影响下酸溶性胶原蛋白的成核期略长于酶溶性胶原蛋白,可能是因为酸溶性胶原蛋白成核需要更稳定的三螺旋链;快速成长期内,酶溶性胶原蛋白形成的自组装材料更为细密,纤维直径远低于相同时期的酸溶性胶原蛋白,且相同自组装条件下酶溶性胶原蛋白自组装速率高于酸溶性胶原蛋白,因此自组装速率可能与成核期胶原纤维长度有关;当自组装材料进入平衡期时,不同胶原纤维团之间会通过水介导的氢键以及其他分子间作用快速“搭桥”形成更粗的高级螺旋结构以及部分云状结构直至凝胶力学结构稳定[18].

图9 鲫鱼皮胶原蛋白自组装不同时期微观结构Fig.9 Carassius carp collagen microstructure at different self-assembly stages

3 结论

(1) 以鲫鱼皮为原料提取酸溶性、酶溶性胶原蛋白，其产量分别为38.32%和13.81%。两种胶原蛋白富含甘氨酸，在218 nm处有特征吸收峰，呈Ⅰ型胶原蛋白特征；两种胶原蛋白具有相似的二级结构特点，含有最高的β-折叠和最低的α-螺旋.

(2) 鲫鱼皮酸溶性、酶溶性胶原蛋白的自组装行为分别受到胶原蛋白浓度、pH值、NaCl浓度和温度等4个因素的影响。在单因素实验的基础上，确定了酸溶性胶原蛋白自组装条件为：胶原蛋白浓度2.1 mg/mL、pH 7.2、NaCl浓度200～600 mmol/L、温度20 ℃；酶溶性胶原蛋白自组装条件为：胶原蛋白浓度1.3 mg/mL、pH 7.2、NaCl浓度200～400 mmol/L、温度20 ℃.