楚刚辉, 姜盼盼

(喀什大学 新疆特色药食用植物资源化学实验室, 化学与环境科学学院, 新疆 喀什 844006)

雪菊是新疆和田、 喀什等地区的一种特色花茶, 具有降血压、 降血糖、 降血脂和抗氧化等功效[1-6], 在新疆多地区已实现规模化种植[7]. 黄酮和其他多酚类物质是雪菊的主要有效成分[8-9], 木犀草苷是雪菊中的一种黄酮类物质, 由木犀草素结合一个单糖组成. 木犀草苷的邻二酚羟基特殊结构使其具有抗氧化、 抗肿瘤、 抗感染和解热抗炎等药理活性[10]. 目前, 植物中木犀草苷的常见分析方法有高效液相色谱法[11-12]、 高效液相色谱-质谱联用法[13-14]、 二维液相色谱法[15]和超临界色谱法[16]等, 这些方法具有良好的选择性, 但操作繁琐、 有机溶剂消耗多且测定时间长. 近红外光谱(NIR)是介于可见与中红外光间的一种电磁辐射光谱, 主要反映有机分子中含氢基团(O—H,N—H,C—H等)振动的倍频和合频的吸收光谱信息. NIR分析测定技术具有无损、 快速、 易实现在线检测等优势, 可用于农业、 烟草和制药等行业产品的质量标准控制[17-18]. 近红外光谱检测限高, 可用于质量分数大于0.1%的组分分析. 为实现近红外光谱的灵敏性检测, 以富集技术与近红外光谱结合进行样品中微量成分的检测研究已引起人们广泛关注[19-21], 如在一定条件下, 木犀草素的邻二酚羟基结构可与某些金属离子配合[22-23]. 木犀草苷是木犀草素结合一个单糖的糖苷类物质， 也可通过其邻二酚羟基结构与金属的配合作用富集样品中的木犀草苷. 本文以新疆巴楚产的雪菊为测试样品, 用制备的铜掺杂二氧化硅作为吸附剂对雪菊所含的微量木犀草苷进行富集, 并通过近红外漫反射光谱结合化学计量学方法实现对微量木犀草苷灵敏、 选择性地检测.

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

AntarisⅡ型近红外光谱仪(美国Thermo公司)； 电子天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)； 电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)； 超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)； TU-1900型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)； SF-TDL-2SOA型低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)； HY-2型多用调速振荡器, JJ-2型增力电动搅拌器(金坛市医疗仪器厂).

正硅酸乙酯(体积分数为98%)， 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES, 体积分数为98%)， 木犀草苷(上海晶纯生化科技股份有限公司, 质量分数为98%)； 乙醇、 CuSO4和NaOH均为国产分析纯试剂； 新疆巴楚产的雪菊, 粉碎机粉碎, 备用.

1.2 方 法

1.2.1 铜掺杂二氧化硅吸附剂的制备 参照同步水解方法[24]制备吸附剂： 将100 mL乙醇加入500 mL三颈烧瓶中, 置于35 ℃水浴中加热, 先加入4.0 mL的APTES, 并将100 mL的2 mol/L CuSO4水溶液和20 mL的正硅酸乙酯搅拌1 h, 再加入w(NaOH)=1%的水溶液20 mL, 滴加结束后, 继续搅拌反应12 h. 在反应过程中溶液逐渐变蓝, 形成蓝色乳状液. 最后, 通过离心分离收集产物, 先用纯净水洗涤至中性, 再用无水乙醇洗涤一次, 收集产物自然晾干后研细, 备用. 铜掺杂二氧化硅吸附剂合成机理如图1所示.

图1 铜掺杂二氧化硅吸附剂合成机理

1.2.2 木犀草苷吸附实验 用铜掺杂二氧化硅吸附剂对木犀草苷进行吸附实验. 在100 mL锥形瓶中先加入0.25 g吸附剂, 再加入50 mL一定质量浓度的木犀草苷或雪菊提取溶液, 在室温下于振荡器中振荡30 min后, 用量筒式过滤器过滤, 在349 nm处测定滤液吸光度. 木犀草苷的吸附率计算公式为

吸附率=[(A0-A)/A0]×100%,

其中,A0和A分别为木犀草苷溶液吸附前后的吸光度.

1.2.3 木犀草苷的HPLC分析方法 用高效液相色谱(HPLC)法测定雪菊提取液中木犀草苷的含量, 以方便精确配制系列雪菊测试溶液. 色谱条件： Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱, 以乙腈(A)和φ(醋酸)=0.2溶液(B)为流动相, 用梯度洗脱的方式： 0 (φ(A)=15%), 0～40 min(φ(A)=15%～90%) ； 流速为1 mL/min； 色谱柱为常温, 进样10.0 μL； 检测波长为349 nm. 配制质量浓度为1.0～300.0 mg/L的木犀草苷标准样品系列, 分别进样10.0 μL, 进行色谱分析. 以木犀草苷的色谱峰面积为纵坐标、 质量浓度(mg/L)为横坐标获得一元线性回归方程：

y=84 016x-2×106,R2=0.994 7.

雪菊提取溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后, 注入色谱仪分析. 图2为雪菊提取液和木犀草苷标准样品的色谱.

图2 木犀草苷标准样品(A)和雪菊提取液(B)的色谱

1.2.4 雪菊提取液的制备与木犀草苷的富集 称取适量雪菊, 分别置于100 mL锥形瓶中, 加入φ(甲醇)=35%水溶液50 mL, 静置过夜后, 超声30 min, 过滤后备用. 按雪菊样品高效液相色谱的测定结果, 制成一系列质量浓度为1.5～19.5 mg/L的雪菊提取液, 共68组. 称取0.25 g一系列铜掺杂二氧化硅吸附剂, 分别置于100 mL锥形瓶中, 再分别加入68组雪菊提取液, 每组均为50 mL. 在常温下振荡吸附30 min, 抽滤, 将滤渣于阴凉处自然晾干. 根据木犀草苷吸附剂不需脱附目标物的性质, 用近红外光谱直接对其进行测定, 获得68个雪菊固体样品的近红外光谱, 其中以16个雪菊样本(5对重复样)为预测模型, 进行近红外光谱分析.

图3 68个木犀草苷样品的近红外光谱

1.2.5 光谱测量方法 用近红外光谱仪测定68个雪菊固体样品光谱, 仪器分辨率为4 cm-1, 在4 000～10 000 cm-1近红外光范围内进行光谱扫描, 测试前仪器预热1 h, 仪器测试过程中, 每运行1 h自动实现校正背景. 为提高雪菊固体样品的测定信噪比并降低误差, 每次测量均进行64次扫描, 每个样品重复测量3次, 将3次数据的平均值作为光谱数据. 68个雪菊固体样品的近红外叠加光谱如图3所示. 近红外光谱自身灵敏度较低, 可通过化学计量学方法与偏最小二乘回归共同实现定量模型的建立和含量预测, 通过仪器软件包TQ analyst 9和MATLAB程序实现建模和预测.

2 结果与讨论

2.1 铜掺杂二氧化硅的红外光谱

图4 氨基二氧化硅和铜掺杂二氧化硅的红外光谱

分别将氨基二氧化硅和铜掺杂二氧化硅与溴化钾按质量比为1∶100～1∶200压片, 在500～4 000 cm-1内进行红外光谱扫描, 结果如图4所示. 由图4可见, 在3 414 cm-1处为氨基的伸缩振动峰, 在1 632,1 541 cm-1处为氨基的弯曲振动峰, 在1 400 cm-1处为亚甲基的弯曲振动峰. 铜掺杂二氧化硅的红外光谱在3 414 cm-1处的吸收峰消失, 这是由于氨基和铜发生了配合作用所致； 氨基的两个弯曲振动峰迁移至1 623,1 512 cm-1处, 这是由于生成铜氨基配合物后形成环状结构, 使共轭体系增强, 吸收峰向低波数区迁移所致.

2.2 铜掺杂二氧化硅的扫描电镜照片

用扫描电镜(SEM)检测铜掺杂二氧化硅颗粒的表面形态, 图5(A)和(B)分别为放大2 000,10 000倍的扫描电镜照片. 由图5(A)可见, 其表面粗糙, 表明材料表面已结合了硅烷化产物； 由图5(B)可见, 材料表面有丰富的孔隙, 可供目标物吸附结合.

图5 铜掺杂二氧化硅的SEM照片

2.3 铜掺杂二氧化硅吸附剂对木犀草苷的吸附

图6 木犀草苷标准液吸附前后的紫外可见光谱

为考察目标组分木犀草苷在铜掺杂二氧化硅吸附剂上的吸附行为, 准确称取0.25 g铜掺杂二氧化硅吸附材料, 置于100 mL锥形瓶中, 加入8.0 mg/L木犀草苷水溶液50 mL, 密塞. 于振荡器中振荡30 min, 量筒式过滤分离, 测量吸附前后木犀草苷溶液的紫外可见光谱, 结果如图6所示. 由图6可见： 木犀草苷的特征吸收波长为349 nm； 与8.0 mg/L的木犀草苷标准溶液的吸收光谱相比, 被铜掺杂二氧化硅吸附材料吸附后的吸收光谱在349 nm处的吸光度明显减少, 吸附率达89.7%, 可见铜掺杂二氧化硅吸附剂对木犀草苷具有良好的吸附作用. 因此， 推测可能的吸附机理为铜离子与木犀草苷配合[22-23], 吸附机理如图7所示.

2.4 木犀草苷的近红外光谱

2.4.1 木犀草苷定量校正模型的建立 用偏最小二乘回归(PLS)建立木犀草苷的定量模型, 为进一步优化该定量模型, 用一阶导数(1st)、 多元散射校正(MSC)、 标准正态变换(SNV)和小波变换(CWT)等方法进行原始近红外光谱预处理[25-26]. 用Monte-Carlo交叉验证(MCCV)法获得定量模型的因子数, 不同光谱预处理获得木犀草苷的定量模型和交叉验证结果列于表1.

图7 木犀草苷的吸附机理

表1 木犀草苷的PLS定量模型及交叉验证结果

图8 木犀草苷的预测质量浓度与参考质量浓度间的关系

由于近红外光谱中包含目标物木犀草苷的光谱信息及铜掺杂二氧化硅吸附材料与其他被吸附杂质的组分信号, 因此需选择合适的光谱预处理方法， 以消除背景干扰对定量预测的影响. 用MATLAB程序建立各种光谱预处理和PLS定量模型, 木犀草苷定量模型的预测能力通过相关系数R、 交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测残差值(RPD)3个参数检验, 其中R反映木犀草苷预测的质量浓度与真实质量浓度的相关程度, RMSECV反映预测质量浓度与真实质量浓度间的偏离程度. 当定量模型的RPD>2.5时, 可实现目标物的定量预测, RPD值越大, 其定量结果越准确[27]. 对照无处理方法, 由表1可见： 经1st,SG平滑,CWT,MSC,SNV,MSC+1st,SNV+1st处理后, RPD值变大, 表明光谱预处理可有效改善定量结果； MSC+1st处理后的相关系数R值最大, RMSECV误差最小, RPD值最大, 表明该方法可有效提取木犀草苷的定量检测信息, 且预测最准确. 由于在样品的近红外漫反射测量模式中出现散射作用, 使原始光谱中含有大量与目标组分吸收无关的干扰信息, 因此对定量模型的稳定性产生影响, MSC可将不同样品光谱中的散射信息校正到同一水平, 从而提高了所得定量模型的可靠性[28], 1st可提高测定信噪比和预测准确度[29], 由于MSC+1st发挥了二者的协同作用, 使预测结果最优. 因此, 本文用MSC+1st方法对雪菊固体样品的近红外光谱进行预处理.

2.4.2 木犀草苷的定量模型验证 为考察木犀草苷定量模型的实际预测能力, 用16个雪菊预测集样品(5对重复样)检验建立的偏最小二乘定量模型. 校正集和预测集的光谱测量设备条件、 雪菊样品制备方法及定量建模方法均相同, 结果如图8所示, 其中校正集样品的散点为黑色圈, 预测集样品的散点为红色圈, 参考质量浓度以HPLC确定的结果为准. 由图8可见, 二者相关关系良好. 当模型的因子数为9时, 测得校正集的相关系数为0.975 0, 预测RMSECV为0.959 8 mg/L, 木犀草苷预测集样品的回收率为82.6%～111.4%. 实验结果表明, 建立的木犀草苷定量校正模型对雪菊预测集样品的预测效果良好, 在有吸附剂和吸附杂质等背景干扰的情形下, 经多元散射校正-一阶导数(MSC+1st)法对雪菊样品的近红外光谱进行预先处理, 可从雪菊样品的复杂光谱背景中获取有效的定量检测信息, 实现准确、 选择性地测量雪菊提取液中木犀草苷的含量.

综上所述, 本文以新疆巴楚产的雪菊为测试样品, 用制备的铜掺杂二氧化硅作为吸附剂, 建立了一种雪菊中木犀草苷的富集和近红外光谱检测方法. 结果表明： 当铜掺杂二氧化硅吸附剂用量为0.25 g、 常温下振荡吸附30 min时, 对雪菊测试溶液中木犀草苷的吸附率达89.7%； 雪菊测试样品的近红外光谱经MSC+1st处理后, 预测结果最好, 当模型的因子数为9时, 测得校正集的相关系数为0.975 0, 预测RMSECV为0.959 8 mg/L, 木犀草苷预测集样品的回收率为82.6%～111.4%. 因此, 通过吸附与富集结合近红外漫反射光谱可实现准确、 选择性地测量雪菊提取液中木犀草苷的含量.