马珍珍 王丽琴 张亚旭 由蕊 郭芷彤 杨璐

摘要利用扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射法（XRD）和红外光谱法（FTIR）对猪皮胶、全蛋、蛋清、蛋黄、牛奶5种常见彩绘文物蛋白胶料老化前后的形貌、结晶度、红外光谱吸收特征和蛋白质二级结构含量进行了对比研究。结果表明，5种胶料老化后，表面规则的结构和纹理遭到破坏，整体变得松散;结晶度降低，尤以牛奶最显著;老化后，5种蛋白胶酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带红外吸收的阶梯状特征仍然明显，但螺旋结构已经解离，且均呈现α螺旋含量降低、β折叠和无规则卷曲含量增高的趋势，说明分子结构从有序趋于无序状态。

关键词形貌; 结构; 蛋白胶料; 土壤埋藏老化; 彩绘文物

1引 言

蛋白类物质来源广， 易获得，是古代彩绘文物最常见的胶料[1，2]，作为颜料的分散和固定剂，也是彩绘文物色彩稳定存在的关键物质[3]。我国拥有大量珍贵的考古出土彩绘文物，土壤埋藏降解是其出土前的主要老化形式，会改变蛋白胶料的形貌和结构，导致彩绘颜料层出现粉化、脱落等病害[4]，降低文物的艺术价值，早期秦兵马俑彩绘脱落就是一个典型的例子。由于蛋白胶料形貌和结构的改变，极大影响了蛋白胶料鉴定的准确性和保护材料的选择，成为制约彩绘文物有效保护的瓶颈问题之一。按照“不改变文物原貌”的文物保护基本原则，要求尽可能使用原有材料进行保护。因此，蛋白胶料的准确鉴定是正确选择保护材料和实施保护的前提和基础，对彩绘文物保护具有重要指导意义。

扫描电子显微镜（SEM）、红外光谱法（FTIR）和X射线衍射法（XRD）等技术是常用的材料表征手段[5，6]，近年来已用于有机质文物形貌观察、结构分析及文物保护中。例如，利用SEM观察丝织品图案金属化过程中Ag的沉积[7]，并用于评估不同方法对纸张中老化动物胶的清理效果[8]。Sotiropoulou等[9]利用FTIR研究希腊史前时期、罗马时期墓葬壁画材质成分，获取了彩绘层蛋白胶料的红外吸收光谱特征信息; 丝绸室内自然老化和人工紫外老化的研究表明，丝绸蛋白无定形区发生氧化、二级结构变化使得晶体结构规则度降低[10]。XRD作为获取生物大分子结构的主要技术之一[11]，也用于文物加固材料性能的表征，Hao等[12]指出，老化丝织品经加固后，结晶度提高、微缺陷被修复，结构排列逐步规则化。本研究以中国古代彩绘文物最常见胶料猪皮胶、蛋类和牛奶[13]为研究对象，利用上述方法探讨了胶料在土壤埋藏老化前后的形貌、结晶度、FTIR吸收特征及二级结构的变化，为文物蛋白胶料的准确鉴定和保护修复材料的选择奠定了科学基础。

2实验部分

2.1仪器、试剂与材料

VEGA3XM钨灯丝型扫描电子显微镜（捷克泰斯肯公司）; Smart LAB型X射线衍射仪（日本理学株式会社）; Bruker Tensor 27型FTIR光谱仪（德国布鲁克公司）; PP20E手动电动一体式压片机（天津瑞岸科技有限公司）; MasterS HitechSciencetool实验室超纯水系统（上海和泰仪器有限公司）。

氨水（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）; KBr粉末（光谱纯，天津天光光学仪器有限公司）; 乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）; 铁粉（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂）; 蛋白胶料：市售全蛋、蛋清和蛋黄（机械分离全蛋获得），银桥全脂牛奶，猪皮胶依据《齐民要术》所述传统制胶技术由市售新鲜猪皮熬制[14]。

2.2蛋白胶样的制备及样品前处理

2.2.1新鲜蛋白样品的制备称取不同质量的猪皮胶（含蛋白85%）、全蛋（含蛋白12.8%）、蛋清（含蛋白11.5%）、蛋黄（含蛋白17.5%）和牛奶（含蛋白3%），使其均含有0.6 g蛋白。蛋白样品用超纯水溶解后于载玻片上成膜，阴干至水份完全挥发后，备用。每种胶制备2组，其中一组按照2.2.3节处理后作为新鲜蛋白样品，另一组按照2.2.2节处理后作为老化蛋白样品。

2.2.2老化蛋白样品的制备取墓葬底土层土若干（本实验用土取自陕西韩休唐墓新鮮开挖的墓葬土，离地表10 m深），参考文献[15]的方法进行样品的土壤埋藏，具体如下：经分样筛（孔径0.2 mm）过筛后排除大颗粒土块等杂质，于255℃下灭菌处理24 h，加超纯水制得含水率12%的灭菌土样，装入玻璃罐中。将2.2.1节制备的另一组胶样埋入土中，并在上、中、下层分别铺置10%的铁粉，将土压实、拧紧罐盖并用蜡密封罐体，遮黑后于5℃存放，使样品处于缺氧、避光、低温、密闭的稳定环境中，以模拟彩绘文物在土壤埋藏中的老化状态。埋藏一年后，清除胶样表面的土，按2.2.3节处理后，制得老化蛋白样品。

2.2.3样品前处理分别取1 g土壤埋藏老化前后的猪皮胶、全蛋、蛋清、蛋黄、牛奶胶样，加入2.5 mol/L氨水溶液2 mL，超声萃取1.5 h，5000 r/min离心5 min，吸取上清液，以排除土壤中无机盐、颜料等的干扰[13，16]。上述操作重复两遍，将上清液烘干，备用。

2.3测试方法及条件

2.3.1形貌观察取3×3 mm蛋白胶样放在粘有导电胶的样品座上，喷金后置于扫描电子显微镜样品仓中，抽真空后观察蛋白胶样的显微形貌。测试条件：电压20 kV，工作距离15 mm，使用二次电子探头。

2.3.2XRD测试取3～5 mg蛋白胶样，研磨至粉末后平铺于单晶硅载物片上并压平，置于X射线衍射仪试样仓中进行测试。测试条件：铜靶，管电压40 kV，管电流150 mA，宽度0.02°，扫描速度15°/min。

2.3.3FTIR测试取3～5 mg蛋白胶样与200 mg KBr粉末混合，研磨至均匀粉末后，用压片机于10 MPa下压制窗片进行FTIR分析。测试条件，扫描次数：64次，波数范围：4000～675 cm，谱带增强因子取3），使用SavitzkyGolay函数对光谱求二阶导。对得到的子峰峰位进行二级结构指认，在Origin 8.5中对谱图各子峰进行多次高斯曲线拟合，使残差最小，根据各子峰面积，计算各二级结构组分的百分含量。

3结果与讨论

3.1蛋白胶样土壤埋藏老化方法的选择

我国幅员辽阔，地下埋藏环境虽受地理位置、水文条件等影响而有所差异，但多数考古遗址和遗物均深埋于地下，如秦始皇兵马俑彩绘陶人和陶马位于地下5 m以下，该层属于底土层（距地表>50～60 cm），土体紧实，环境缺氧、无光、低温，物质代谢极其缓慢，地表气候很难影响到该层。因此，本研究选择缺氧、避光、低温、稳定密闭的底土层土壤进行文物蛋白胶样的老化实验。

3.2形貌观察

由SEM结果（图1）可知，土壤埋藏老化后，5种胶料微观形貌均出现不同程度的变化。全蛋、蛋黄和牛奶样品出现溶蚀、鳞片化及脱落现象，其中，蛋黄和全蛋样品（图1C、1D、1G和1H）的整体完整性未遭到破坏，而牛奶样品（图1I和1J）出现了碎裂，分散成大小不等的块体; 蛋清样品整体结构发生明显断裂（图1E和1F）; 猪皮胶样品（图1A和1B）老化后结构出现轻微疏松化，但整体形貌变化最小，土壤埋藏老化的样品稳定性最高。

3.3XRD分析

由5种蛋白胶料土壤埋藏老化前后的XRD结果（图2）可以获取其特征峰所对应的衍射角（2θ）、峰半高宽度（β）及峰面积（Area），利用Bragg方程、Scherrer公式分别计算晶面间距（d）和晶粒大小（D），其中入射X射线Cu靶波长为0.154 nm，Scherrer常数取0.89，结果见表1。

猪皮胶和牛奶样品经1年老化后的衍射角不变，蛋类的衍射角样品较老化前略有减小，但降幅极低（<1%）。根据文献[17]可知，衍射角变化不大，说明土壤埋藏老化未改变蛋白胶的物质成分。

由Bragg方程计算所得的晶面间距可知，蛋类（包括全蛋、蛋清和蛋黄）样品老化后的d值略增（<1%），猪皮胶和牛奶样品均未变化，说明土壤埋藏老化对5种蛋白胶料的晶面间距无明显影响。

由Scherrer公式计算所得的晶粒大小可知，老化前后5种胶的D值变化程度较低（<5%），说明土壤埋藏老化并未明显影响晶体尺寸。

所有胶老化后，吸收峰面积均减小，但减少程度不同，其中牛奶样品减少最显著（67%），蛋清和全蛋样品减少程度居中（23%～43%），蛋黄和猪皮样品的变化小（分别减少9%和2%）。由此可知，猪皮样品最稳定，蛋黄样品次之，牛奶样品老化最严重。由文献[18]可知，峰面积与结晶度呈正相关。因此，土壤埋藏老化使蛋白胶料的结晶度均降低，蛋白质的有序性降低。

3.4FTIR分析

由老化前后的FTIR谱图（图3）可见，5种蛋白胶在老化后出现1654～1657 cm

5种蛋白胶的α螺旋含量均明显降低，其中，蛋清样品降低最显著（39.06%）。5種蛋白胶的β折叠含量呈增加趋势，平均增量为5.79%。猪皮胶和蛋黄样品的反平行β折叠结构、平行β折叠结构含量基本未发生改变，而其余3种样品的反平行β折叠含量减少（7.05%～13.96%），平行β折叠含量增加（14.01%～23.89%）。5种蛋白胶的无规则卷曲含量增加，平均增量为11.93%; β转角含量呈升高趋势（4.10%～15.97%）。猪皮胶和蛋黄样品的6种二级结构含量变化整体小于其它样品，从分子层面说明其土壤埋藏稳定性相对较高。

5种蛋白胶的二级结构含量均存在α螺旋含量降低、β折叠和无规则卷曲含量升高的变化规律，牛奶样品的变化尤为显著，说明所有胶料结构均从有序趋于无序状态[25]，与上述XRD有序性降低、酰胺A带变宽、结构出现解螺旋的结论相吻合。胶料蛋白的二级结构会出现上述变化是因为富含α螺旋的蛋白质存在由α螺旋向β折叠转变的趋势[26]。Chen等[27]使用统一的势能模型计算出α螺旋和β折叠的势能，指出前者的势能（Symbolm@@7.1ε）高于后者（Symbolm@@7.4ε），前者可转化为后者。Ding等[28]通过离散分子动力学算法得出α螺旋、β折叠和无规则卷曲的熵值（α螺旋<β折叠<无规则卷曲）。由热力学第二定律可知：在自然过程中，一个孤立系统的总混乱度（熵）会增大（熵增原理）。因此，土壤埋藏老化后，胶料呈现α螺旋含量降低 、β折叠和无规则卷曲含量增大的趋势。

3.5不同蛋白胶料土壤埋藏稳定性差异的讨论综上，由几种常见蛋白胶料的显微形貌、结晶度、FTIR吸收和二级结构含量变化可知，猪皮胶的土壤埋藏老化稳定性高于其它样品，这取决于其分子组成和结构。

3.5.1分子中疏水性氨基酸含量的影响

本研究组前期研究获取了猪皮胶、全蛋和牛奶样品的氨基酸含量分布特征[29]，其中，猪皮胶含疏水性氨基酸丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）高达73.11%，而全蛋和牛奶样品含疏水性氨基酸仅52.19%和52.40%。同时相关研究表明，含疏水性氨基酸[30]高的蛋白质，稳定性通常更高[31]。因此，从分子中疏水性氨基酸含量影响可知，猪皮胶土壤埋藏的稳定性高于蛋类和牛奶样品。

3.5.2蛋白结构的影响猪皮胶的主要成分胶原蛋白为非常特殊的螺旋结构，具体而言，GlyXY（X和Y 为Gly之外的氨基酸，X 主要是 Pro，Y 主要是羟脯氨酸Hyp）三肽周期结构先组成左手螺旋肽链，3条此肽链再以右手螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构[32，33]。猪皮胶这种独特的结构比含球状[34]、球状胶体[35]的蛋类和牛奶样品的稳定性更高。

4结 论

通过对5种常见彩绘文物蛋白胶料在土壤埋藏老化前后的形貌、结构的对比研究表明，老化胶料表面规则结构和纹理均遭破坏，整体变得松散化，胶料的衍射角、晶面间距和晶粒大小基本保持不变，结晶度整体减小。老化胶料虽具有蛋白质酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带红外光谱的典型吸收特征，但α螺旋含量降低、β折叠和无规则卷曲含量增高，说明蛋白结构从有序趋于无序状态。在5种胶料中，牛奶的形貌、结构变化相对较大，而猪皮胶相对小，说明后者的土壤埋藏老化稳定性优于前者。后期可进一步展开老化前后氨基酸一级结构含量的分析，以探讨一级结构与二级结构变化之间的关系，为彩绘文物的劣化机理研究提供科学依据。

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