邓俊杰 ABDUL MAJEED BALOCH 侯雪月 李嘉哲 茶新有 张荣沭

(东北林业大学园林学院，哈尔滨 150040)

近年来我国的土壤退化现象十分严重，相关部门及政策都要求降低化学农药和肥料的使用量，大力支持和鼓励生物肥料的开发和利用，其中就包括木霉菌(Trichodermaspp.)。木霉菌属真菌门(Eumycota；Mycobionta)，半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，木霉属(Trichoderma)，是自由生活的真菌，常见于各种生态系统的土壤、腐烂的木材和叶凋落物等分解材料中[1]。木霉菌主要通过寄生作用对植物产生影响。木霉菌有很强的根部定植能力，在植物的根基部位能分泌一些抑制病原真菌的生长或者为植物生长提供养分的物质[2]，还能通过调节植物体内激素水平[3～4]、固定大气中的氮[5]、提高植物对磷的吸收[6]以及通过产生铁载体提高植物对矿物质的吸收[7]，从而促进植物的生长。

月季(Rosachinensis‘Shi-Jie-Mei’)作为一种集观赏、食用和药用等多用途的木本花卉植物[8]，具有很高的经济价值，近年来其栽培面积逐年上升，运用生态环保的肥料促进其生长和有效抑制其生长过程中的病害发生是十分必要的。木霉在月季根部定植后，可以产生抗生素和植物生长调节剂，抑制或降解根际有害物质、增加养分利用率，从而促进月季生长。笔者将盆栽月季根施哈茨木霉T6，并系统分析月季硬枝出芽率；枝条和叶片性状；内源激素水平和防御酶活性的变化，以期为月季繁殖提供新的方法，并为研制促进月季生长的生防木霉菌肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

木霉菌：从黑龙江省牡丹江火山岩台地生长的蒙古栎根际土壤样本中分离纯化获得寒地习居哈茨木霉T6(Trichodermaharzianum)菌株[9]，菌种由东北林业大学园林植物应用实验室保存。

月季：月季硬枝条，购于黑龙江省佳木斯市南岗苗木专业合作社。

1.2 木霉菌分生孢子培养方法

1.3 木霉菌施入方法

2017年2月末将越冬后约15 cm长的月季硬枝条在温室进行盆土扦插培养，土壤为大田土∶细砂土=3∶1，处理组每盆土壤中拌入100 mL木霉分生孢子悬浮液，以未施用木霉的实验组为对照，每实验组5株苗，3个重复。在保持相对湿度高于80%条件下培养，从出芽开始统计出芽数，每天统计1次，第25天统计后计算出芽率(出芽率=总出芽数量/硬枝数量)。

待硬枝条叶腋上发出嫩芽大于2 cm时(见图1B)，连同茎段一起剪下埋入盆土中继续保湿培养。5月15日将幼芽(见图1C)移入东北林业大学园林学院苗圃进行自然条件下盆栽培养，此时处理组不加木霉菌。为了观察木霉菌对月季生长的影响，暂未作剪枝处理。并于6月15日、7月15日和8月15日，处理组分别施入100 mL木霉分生孢子悬浮液，根据天气情况进行浇水和除草管理。

1.4 月季枝条数量和长度测量方法

9月15日记录每株月季苗的枝条数，并用卷尺测量枝条长度。

1.5 月季茎和叶片生物量测量方法

摘取每株月季最高枝条顶端第3节间的叶片，称重后置于液氮中速冻，带回实验室，-80℃保存，用于酶活性和激素水平测定。在距土表面15 cm处，将月季苗所有枝条剪下，放入冰盒中带回实验室。将采集的月季样本的枝条和叶片分开，用电子秤分别称量，得出鲜重。再将枝条和叶片用烘干箱105℃杀青30 min，然后80℃烘干至恒重，再次称量得出干重。

1.6 月季叶片防御酶活性检测方法

酶液提取：取超低温保存的月季叶片0.5 g，按照李合生的方法制备防御酶粗提液。参照李合生等[10]的氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)的活性、紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)的活性。

1.7 月季叶片内源激素水平检测方法

(1)内源激素提取方法：根本Zhai T T等的方法[11]提取月季内源激素。

(2)LC-MS条件：色谱条件：流速：1 mL·min-1；柱温25℃；进样量10 μL；进样延迟5 min。流动相由甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)组成，梯度洗脱条件参照文献Zhang等[12～14]和Zhai等进行。质谱条件：采用API3000三重四极杆质谱仪在负离子模式下进行操作。电喷雾离子源(ESI)条件及CID-MS/MS参数优化结果与文献Zhang等和Zhai等相同(见表1)。用Analyst software(1.4版本)进行数据处理。

1.8 数据处理方法

采用Microsoft office excel 2007软件进行绘制图表，利用SPSS对不同处理间的差异显著性进行ANOVA分析，在P=0.05下比较差异性。

图1 哈茨木霉对月季生长的影响 A.月季发芽率；B.硬枝幼芽；C.月季幼苗；D.采样前的生长状态；E.月季枝条数量和长度Fig.1 Effect of T.harzianum T6 on rose growth A.Germination rate of rose; B.Hard branches budlet; C.Rose seedlings of CK and T group; D.Growth status before harvest; E.The number and length of rose branches

表1 用于激素检测的质谱参数

2 试验结果

2.1 哈茨木霉T6对月季苗生长的影响

由图1A～B可见：木霉菌处理有利于硬枝幼芽的发育，扦插的月季硬枝在第10天开始出芽，处理组3个，对照组2个；统计到第25天时硬枝不再出芽。结果发现木霉菌处理的硬枝出芽快、数量多，是对照组出芽率的1.4倍(P<0.05)。并且，月季硬枝早期接种木霉菌有利于幼苗后期的生长(见图1C)。月季枝条长度和数量测量结果表明，与对照组(CK)相比，处理组(T6)月季苗的平均长度为71.7 cm，比CK组增加81.84%，生长速度显著提高(P<0.05)；此外，T6组月季苗平均新生枝条数为1.4条，比CK组增加7.69%，但差异不显著(P>0.05)(见图1D～E)。生物量测量的结果表明，与CK组相比，T6组月季苗枝条的平均鲜重为15.3 g，增加了41.67%(P<0.05)；平均干重为7.5 g，增加了33.93%(P<0.05)。T6组叶片的平均鲜重为18.0 g，增加了59.29%(P<0.05)；

1.3.3 加强田间管理 发病初期及时拔除病株，并在田外销毁。施足有机肥，增施磷、钾肥，提高植株自身的抗病性，减轻病害；栽培前期及时供水，浇水后及时松土，提高地温，促进发根；栽培中期注意通风，防止徒长，促花保果。

表2 哈茨木霉菌对月季苗生物量的影响

Table 2 Effects ofT.harzianumT6 on the biomass in branches and leaves of rose

鲜重Fresh weight(g)干重Dry weight(g)枝条Branch叶Leaf枝条Branch叶LeafCK10.8±1.4b11.3±2.1b5.6±0.6b5.5±0.9bT615.3±2.6a18.0±3.2a7.5±1.2a7.8±1.4a

平均干重为7.8 g，增加了41.82%(P<0.05)。说明施用木霉菌能显著提高月季苗枝条和叶片的生物量产量(见表2)。

2.2 哈茨木霉T6对月季苗防御酶活性的影响

分析结果表明，T6组SOD活性比CK组提高了24.44%(P<0.05)(见图2A)；T6组叶片中POD活性比CK组提高了76.23%(P<0.05)(见图2B)；T6组叶片中SOD活性比CK组提高了19.95%(P<0.05)(见图2C)。因此，施用木霉菌能使月季苗叶片中SOD、POD和CAT的活性均显著提升。

图2 月季苗的防御性酶活性Fig.2 Defense enzyme activity of rose

图3 月季叶片中激素水平Fig.3 Hormon levels in the leaves of rose

2.3 哈茨木霉T6对月季叶片内源激素水平的影响

分析结果表明，T6组月季苗叶中IAA，GA3和ZT的水平均有增高。IAA水平提高最显著，为220.0 ng·g-1FW，与CK相比增加了135.47%(P<0.05)(见图3A)。GA3和ZT的激素水平分别为16.4 ng·g-1FW和0.9 ng·g-1FW，与CK组相比分别提高26.51%和45.24%(见图3B～C)。T6组月季苗叶中ABA含量为2 709.1 ng·g-1FW，比CK组提高了78.08%(见图3D)(P<0.05)。JA和SA的含量分别为465.1 ng·g-1FW和5 845.0 ng·g-1FW，分别比CK提高了44.64%和53.51%(见图3E～F)(P<0.05)。说明施用哈茨木霉T6能提高月季苗叶中激素的含量，从而促进月季的生长。

3 讨论

本研究结果发现，哈茨木霉T6显著提高了月季硬枝的发芽率，能够使获得的月季幼苗比未接种木霉菌的长势强壮。将获得的月季苗从温室移至自然条件下生长4个月，发现木霉菌诱导能显著提高月季幼苗的枝条长度和枝条数目，并且对枝条和叶片的生物量的积累及叶片的保水能力也有促进作用。其中月季叶片生物量受哈茨木霉影响最显著，叶片鲜重与CK组相比增加了59.29%(P<0.05)。此外，处理组月季苗叶片中的防御酶活性也显著提高，其中POD的活性增加最大，提升了76.23%，其次为SOD，最后为CAT。而且，处理组的月季叶片中内源激素IAA、GA3、ZT、ABA、JA、SA的水平均有提高，其中IAA的水平比CK增加最显著，提升了135.47%(P<0.05)。

木霉菌是一种能够促进植物生长，诱导植物提高抗性，同时抑制病原菌生长的环境友好型生防真菌，具有改良土壤和预防植物病害发生的作用[2～7]。近代植物病理学认为，利用生物或理化因子处理植株后所产生的抗病性称为诱导抗病性[15]，改变植物对病害的反应产生局部或系统的抗性，能诱导植物产生抗性的物质称为激发子[16]。Bailey和Lumsden的研究[17]揭示了木霉菌的木聚糖酶或其他的激发子能够诱导植物的抗病性，Elad[18]等利用哈茨木霉接种根部或叶子后，认为木霉菌促进植物生长的重要机制之一是诱导植物产生系统抗性。Windham[19]在固定的悉生环境下，进行了哈茨木霉和康宁木霉刺激植物生长的实验，在玉米、马铃薯、烟草和红萝卜上均表现出了高发芽率、高出苗率及植物干重增加的结果。这与本研究的结果：哈茨木霉T6能提高月季硬枝发芽率、促进月季生长、提高月季对有机物质的积累结果一致。

超氧化物歧化酶SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等[20]。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞的伤害。过氧化物酶POD具有氧浓度的调节作用，同时能使毒性物质失活。过氧化氢酶CAT是一种重要的保护酶类，它能促使过氧化氢分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。我们的研究结果表明木霉T6能提高月季苗中SOD、POD和CAT的活性，增强对自然条件下不良环境的抵抗能力，从而促进月季的生长。

激素在植物的生长发育中起着重要的调控作用，它作为信号分子在时间和空间上调控植物发育的许多过程。IAA为促生长类激素，对植物的生长发育主要起促进作用[21]。王进等[22]在梨树上的研究表明，IAA的含量多少与新梢抽发和快速生长存在一定的相关性，本研究发现T6组月季叶片中IAA的水平较CK组显著提高(P<0.05)，T6组较快的生长量和较大的生物量可能与高水平的IAA相关。现在多数研究表明GA有促进破眠的作用。闫海霞等[23]发现，把低温层积处理的月季种子置于100 mg·L-1GA3中浸蘸，可有效提高其萌发率。ZT可以促进细胞分裂，抑制不定根和侧根生长，延缓叶片衰老，与植物抗逆性密切相关[24]。汤章城[25]认为ZT可以降低根系对水分的透性，减少气孔阻力，因此胁迫期间ZT含量的降低，减少了细胞分裂，不利于叶片的伸长，但有利于植物保持较高的水分状态，是一种保护性的生理反应[26]。尽管检测的GA3和ZT水平均高于CK组，但都没有达到显著差异，木霉处理提高了叶片含水率是否与ZT调控有关，其机理有待于进一步研究。ABA在种子的发育、休眠、萌发以及植物的营养生长、环境胁迫响应等过程中具有重要作用，ABA和JA是植物应答生物胁迫与非生物胁迫的重要信号分子，许多逆境条件下植物体内ABA或JA含量升高，植物的抗逆性增强[27～28]。SA是植物体内自身合成的酚类化合物，它能够激活植物过敏反应和系统获得性抗性[29]。本研究发现T6组月季叶片中ABA、JA和SA水平均显著高于CK组，并且与抗性相关的活性酶含量均显著高于对照组，这些或许与处理组较快的生长速度使其强壮，从而增强了对生长过程中自然条件下的各种胁迫的抵抗能力。

姚志红等[30]认为山新杨根际接种木霉菌能降低叶片上侵染病原菌对植株的危害，通过调整植物内源激素水平使之趋于未受病原菌侵染时的状态，以此来维持植物正常生长。Ying[31]等人在土壤中筛选出58株木霉，用它们分别培养番茄植株发现，木霉显示出促进植物生长的作用，包括提高IAA的激素水平。Christmann结论得出[32]，木霉菌增加了激素对植物内部防御的反应水平。由于本研究材料是硬枝扦插获得的幼芽长大的月季苗，自然条件下生长的第一年并没有开花，木霉菌对月季开花的影响有待于进一步验证。

化肥和农药在增加作物产量的同时，也同样带来了负面影响，因此，微生物菌肥得到了人们的青睐。如今国内有关于生防菌肥对月季生长促进的相关研究较少，实验结果说明木霉菌具有促进月季生长、提高其防御酶活性和激素水平的作用，研究结果为研制促进月季生长的生物菌肥以及针对木霉对月季开花的促进作用的研究提供理论依据。