罗爱芹，刘红阳，张鑫，陈炜杰，李园园，孙立权

(北京理工大学 生命学院，北京 100081)

蛋白质作为生理功能的执行者和生命现象的体现者，其检测方法在生命科学的研究中具有重要意义.传统的蛋白检测技术，如蛋白芯片技术、分子生物学检测方法、电泳法、质谱分析方法等通常成本较高，耗时耗力，因此有必要开发一种低成本、高效的蛋白质检测方法.分子印迹技术(molecular imprinting technology, MIT)是一种制备出对模板分子具有特异性识别能力的聚合物的技术，该聚合物也称为分子印迹聚合物(MIPs).MIPs具有较高的稳定性，能够承受较大的温度、压力和pH变化，因此在色谱填料、生物材料模拟和固相萃取等领域有着广泛的应用.目前，应用于小分子的分子印迹技术已经比较成熟，但很难推广到生物大分子中，这主要是由蛋白质分子量大、结构复杂、构象多变、洗脱困难等原因造成的.量子点(quantum dots，QDs)是一种具有纳米晶体结构的半导体材料，他们具有独特的光电特性，如高量子产率、斯托克斯位移大、光学特性稳定[1]等.量子点广泛应用于荧光标记和细胞成像、太阳能电池、传感器和光学器件等领域[2].将量子点与分子印迹技术相结合，可制备基于量子点的分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs)，该传感器兼具量子点作为荧光材料的检测优越性和分子印迹聚合物材料对模板蛋白的检测分析和选择吸附能力.此外，这种具有“核-壳”结构的印迹聚合物在捕获模板分子后，会由于量子点与模板分子之间的电子能量传递而导致量子点的荧光猝灭，将生物分子识别过程转化为光学信号分析.

血红蛋白(Hb)是维持有机生命体进行正常生理活动的重要介质，在氧气和二氧化碳的输送及维持血管系统血流中的pH平衡中起着关键作用[3].Hb在其4个分子亚基中的结构失调可导致各种遗传性疾病，例如镰状细胞性贫血、地中海贫血等.因此，Hb的检测分析有着重要的意义.由于牛血红蛋白(BHb)与人血红蛋白有90%的相似性[4]，且价格低廉、便于获取，故本文选用BHb代替人血红蛋白作为目标蛋白进行检测分析.实验通过化学共沉淀法合成硫化锌量子点，并使用L-半胱氨酸进行修饰.以L-半胱氨酸修饰硫化锌量子点为印迹载体，丙烯酰胺(AAm)、甲基丙烯酸(MAA)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为功能单体，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，采用表面印迹技术制备了BHb的分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs).该生物传感器灵敏度高、检测限低、响应时间快，还具有温敏特性，可以在复杂的生物样品中快速识别和检测目标蛋白.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

1.2 L-Cys修饰的ZnS量子点的制备

ZnS量子点的制备步骤参照文献[5]，简单如下：将6.25 mmol ZnSO4·7H2O，0.5 mmol MnCl2·4H2O以及20 mL去离子水依次加入到50 mL三口瓶中，混合物在氮气保护下搅拌30 min，将7.5 mmol Na2S·9H2O溶液逐滴加入到三口瓶中，室温下继续搅拌反应2～3 h，即可得到锰掺杂的ZnS量子点；然后，将3.75 mmol L-Cys加入到混合物中，常温避光继续搅拌反应12 h.合成产物在6 000 r/min下离心8 min后，用水和乙醇反复洗涤若干次，真空干燥后即可得到L-Cys修饰的ZnS量子点.

1.3 量子点-分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs)的制备

将100 mg L-Cys修饰的ZnS量子点和10 mg BHb分散于20 mL PB缓冲液中(0.02 mol/L，pH=6.9，下同)，在120 r/min的转速下常温孵育1 h；另取20 mL PB缓冲液，在其中加入30 mg丙烯酰胺(AAm)、100 mg N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、30 μL甲基丙烯酸(MAA)和25 mg N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，混匀后加入上述混合液中，并置于摇床中继续孵育1 h；将混合物吹氮气10 min，在机械搅拌下加入10%过硫酸铵(APS，质量分数)溶液100 μL和30%四甲基乙二胺(TEMED，体积分数)溶液100 μL，在氮气保护下反应24 h；最后将产物收集离心，冷冻干燥后即得到量子点-分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs).非分子印迹聚合物(QD@NIPs)的制备过程除不加BHb外，其他均相同.

1.4 表 征

实验采用高分辨率透射电镜(JEM2100，日本)对合成的QDs、QD@MIPs等材料进行形貌和微观结构分析；使用傅里叶红外光谱仪(BX FT-IR，珀金埃尔默，美国)测定合成的QDs、L-Cys-QDs、QD@MIPs、QD@NIPs、BHb等材料的红外光谱谱图；使用荧光分光光度计(RF5301，岛津，日本)测定荧光光谱，狭缝宽度为5 nm，最大激发波长为318 nm；使用紫外分光光度计(UV-1800，岛津，日本)测定紫外吸收光谱和吸光度，紫外吸收波长为280 nm.

1.5 吸附动力学

为了测定QD@MIPs的吸附平衡时间，对其吸附动力学进行了研究.分别将8 mg的QD@MIPs和QD@NIPs分散于40 mL PB缓冲液中，各加入2 mg BHb，每3 min测定一次荧光强度.

1.6 选择性和特异性

本实验以BSA、Lyz和OVA为参照蛋白，研究QD@MIPs的选择性.步骤如下：在10 mL离心管中加入1 mL 1 mg/mL QD@MIPs溶液、100 μL 2.5 mg/mL的BHb溶液和3.9 mL的PB缓冲液，15 min后测定其荧光强度，分别使用BSA、Lyz和OVA代替BHb重复上述过程.作为对照，使用QD@NIPs重复上述过程.对于特异性，同样选用BSA、Lyz和OVA作为竞争蛋白.分别将0，25，50，100，200 μg/mL的竞争蛋白加入上述混合液中，并在15 min后测定混合物的荧光强度.

1.7 温敏性研究

N-异丙基丙烯酰胺是一种常用的温敏材料，其在32 ℃左右的水溶液中具有较低的临界溶解温度(LCST)，而且可以在热刺激下控制体积收缩/膨胀，实现其疏水/亲水性质的突变等[6].本实验也考察了制备的QD@MIPs在不同温度下的吸附和洗脱效率，具体方法如下：设置QD@MIPs分别在-15，0，20，25，30，35，40，45 ℃温度梯度下洗脱，洗脱采用10%乙酸-乙腈溶液，洗脱6 h后分别测定前后荧光变化；设置质量浓度为0.2 mg/mL的洗脱后QD@MIPs分别在0，20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃温度梯度下吸附，BHb的质量浓度为50 μg/mL，分别测定吸附前后荧光强度变化.

1.8 实际样品分析

实验采用标准加入法测定QD@MIPs在实际样品中的应用能力，鸡蛋清购买于当地市场，人尿液样品随机采集于健康志愿者.将样品稀释200倍进行实验，在实际样品中分别加入0，30，50，100 μg/mL的BHb溶液、1 mL 1 mg/mL的QD@MIPs溶液和一定量的PB缓冲液，使得QD@MIPs的质量浓度为0.2 mg/mL，混合物总体积为5 mL，在15 min后使用荧光分光光度计测定混合物的荧光强度.

2 结果与讨论

2.1 量子点-分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs)的制备

量子点-分子印迹聚合物(QD@MIPs)的制备过程如图1所示：首先通过化学共沉淀法合成了ZnS量子点，其次使用L-半胱氨酸通过配体交换对ZnS量子点进行了表面修饰，这既降低了量子点的毒性，又提高了量子点的分散性和生物相容性.然后以L-半胱氨酸修饰的ZnS量子点为印迹载体，选用丙烯酰胺(AAm)、甲基丙烯酸(MAA)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为功能单体，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，BHb为模板蛋白，再在引发剂过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的作用下在量子点表面印迹形成具有“核-壳”结构的量子点-分子印迹聚合物.采用10%乙酸-乙腈溶液在0 ℃下洗脱后，量子点表面印迹聚合物层留下与模板蛋白BHb形状大小相匹配的印迹空穴.当分子印迹量子点材料再次结合模板蛋白后，由于模板蛋白与量子点之间的电子能量传递作用，会对量子点荧光强度造成影响表现出明显荧光猝灭现象.根据这一现象，通过检测荧光信号的变化可以分析模板蛋白与印迹聚合物的结合情况，计算样品中模板蛋白的浓度.因此，实验制备的量子点-分子印迹聚合物可作为一种新型生物传感器应用于目标蛋白的分析检测.

这完全出乎张仲平的意料，觉得初次见面不该开那么过份的玩笑，与此同时，他倒是增加了对曾真的好感，毕竟，现在还会脸红的女孩子可是不多了。

2.2 表 征

2.2.1透射电镜(TEM)表征

L-Cys修饰的ZnS量子点与QD@MIPs的TEM透射电镜结果如图2所示.从图2中可知，制备的L-Cys修饰的ZnS量子点粒径较小，尺寸均一，直径大约为4 nm，可以看到明显的晶格结构；制备的QD@MIPs同样分散均匀，尺寸略大，约为6～7 nm，这说明印迹层的包覆影响了量子点的大小，从中可以推算印迹层的厚度约为1～2 nm，相对较薄，有利于QD@MIPs材料对模板蛋白的洗脱和结合，这也是材料对模板蛋白荧光响应快速的原因.

2.2.2傅里叶红外光谱(FT-IR)表征

实验对相关材料进行了傅里叶红外光谱表征，结果如图3所示.通过对比图3(a)中BHb和QD@MIPs的红外光谱谱图可以发现，二者在1 420 cm-1左右均有较强的酰胺键中C-N键伸缩振动吸收峰，而在QD@NIPs的红外光谱谱图中并未发现，这说明BHb成功地印迹在QD@MIPs中；对比图3(b)中QD和L-Cys-QD的红外光谱谱图可以看到位于3 500～3 000 cm-1，1 600～1 550 cm-1和1 400 cm-13处的羧基COO-基团的振动吸收峰，位于3 420～2 900 cm-1的氨基-NH2基团的振动吸收峰和800～600 cm-1的C-S键伸缩振动吸收峰，而在QDs的谱图的相应位置没有发现对应的吸收峰，这说明L-Cys成功地修饰在量子点的表面上.

2.3 吸附动力学

如图4(a)所示，制备的QD@MIPs生物传感器的荧光猝灭在15 min内随着QD@MIPs/QD@NIPs对BHb吸附量的增加而逐渐降低.最后，15 min左右荧光猝灭无明显变化，说明QD@MIPs/QD@NIPs对BHb的吸附达到平衡.

2.4 BHb的检测

由于光诱导的电子转移过程，模板蛋白对QD@MIPs生物传感器的荧光猝灭遵循Stern-Volmer方程，公式如下

F0/F=KSV[c]+1,

(1)

式中：F0为初始荧光强度；F为加入蛋白质后的荧光强度；KSV为荧光猝灭常数；[c]为蛋白质刚加入时的浓度.根据上述公式计算不同蛋白质对应的KSV值并作图.

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)检出限的规定，本方法检出限按照如下公式计算

DL=KSb/S，

(2)

式中：Sb为空白20次测得信号的标准偏差；S为方法的灵敏度(校准曲线斜率).取K=3时计算方法的检出限.

实验研究了不同质量浓度BHb对QD@MIPs生物传感器的荧光强度影响，并计算荧光猝灭效率，如图4(b)所示.从图中可以明显看出，在BHb较低的0.15～2.30 μmol/L浓度范围内，QD@MIPs荧光猝灭程度对BHb浓度呈良好的线性关系，R2为0.986 9.其检测方程为

F0/F=0.4367[cBHb]+1，

式中[cBHb]为BHb的浓度(μmol/L).根据式(2)计算制备的QD@MIPs对模板蛋白(BHb)的检测限为0.097 μmol/L.因此，该方法可作为一种定量分析BHb的可靠手段.

2.5 温敏性实验

实验分别测定了洗脱和吸附前后的荧光强度变化.如图5(a)所示，在0 ℃的条件下洗脱，洗脱前后的荧光强度变化最大，即在该温度下洗脱效率最高，这是因为在较低的温度下，N-异丙基丙烯酰胺所在的印迹聚合物层的亲水性增强，更容易与强极性的洗脱剂形成氢键，有利于模板蛋白在聚合物层的释放；从图5(b)中明显看到，随着温度的升高，模板蛋白BHb对QD@MIPs的猝灭效率不断升高，这是因为随着温度的升高，N-异丙基丙烯酰胺的存在使印迹聚合物层由亲水性转变为疏水性，印迹聚合物层与模板蛋白的疏水作用增强，吸附性能增加，故而模板蛋白对QD@MIPs的猝灭效果也在升高.在达到50 ℃时，继续升温对猝灭效率没有明显的改变，考虑到过高的温度可能会使BHb变性以及对量子点的稳定性有影响，因此选择50 ℃作为BHb的最适检测温度.

2.6 选择性和特异性

采用印迹因子(IF，KSV,MIP/KSV,NIP)来评价QD@MIPs生物传感器的选择性.如图6所示，BHb的KSV, MIP值明显高于其他参照蛋白，且IF为3.08，说明QD@MIPs对模板蛋白BHb具有较高的选择性.实验同样考察了QD@MIPs生物传感器的特异性，将不同浓度的BSA、Lyz、OVA分别与BHb混合，研究其特异性识别能力，如图6(b)～6(d)所示.从图中可以看出，改变不同浓度的BSA、Lyz和OVA对由BHb产生的荧光猝灭没有明显影响，这是因为印迹“孔穴”的识别位点与其他参照蛋白不匹配，从而导致3种参照蛋白对QD@MIPs的荧光猝灭机会较小.因此，QD@MIPs生物传感器对BHb检测具有良好的特异性.

2.7 实际样品分析

实验进一步研究了制备的QD@MIPs生物传感器在鸡蛋清和人体尿液样品中的实际应用能力.由表1可知，QD@MIPs生物传感器对蛋清样品的回收率为99.92%～102.43%，相对标准偏差(RSD)为2.3%～4.5%，对人尿液样品的回收率为100.30%～104.79%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～4.1%.因此，QD@MIPs生物传感器对于真实样品中BHb含量低的灵敏、准确测定具有实际应用价值和可靠性.

将制备的QD@MIPs生物传感器的检测性能与其他工作进行对比，如表2所示.从中可以看出，与其他工作相比，本实验中制备的QD@MIPs对目标蛋白BHb的响应时间较短，检测限较低.另外，本实验中使用的ZnS量子点具有较低的生物毒性和较好的生物相容性，更适合于生物样品的检测和分析.

表1 QD@MIPs生物传感器在鸡蛋清和人尿液样品中检测BHb的回收率和RSD

Tab.1 Results of spiked recoveries and RSD for detection of BHb in egg albumen and human urine sample using QD@MIPs biosensor

样品加入量/(μg·mL-1)检测量/(μg·mL-1)回收率±RSD/(%,n=3)鸡蛋清00-3030.73 102.43±2.35049.9699.92±3.1100100.77100.77±4.5人尿液00-3031.43104.79±3.65050.15100.30±2.5100101.24101.24±4.1

表2 QD@MIPs生物传感器的分析检测性能与其他工作的对比

3 结 论

本文以L-半胱氨酸修饰的ZnS量子点为印迹载体，采用表面印迹技术制备了量子点-分子印迹聚合物生物传感器(QD@MIPs)，并应用于BHb的检测分析.结果表明，制备的QD@MIPs对目标蛋白BHb有快速的响应时间，可在15 min内实现吸附平衡.同时，该生物传感器具有温敏性，在不同的温度条件下表现出不同的洗脱和吸附效率，通过调节温度可实现对模板蛋白的高效吸附与释放.除此之外，BHb在0.15～2.30 μmol/L的浓度范围内，其对QD@MIPs的猝灭程度与浓度呈良好的线性关系，R2为0.986 9.与传统的分子印迹聚合物相比，这种生物传感器制备过程简单，成本较低，操作简便，具有良好的选择性和特异性识别检测和定量分析目标物的能力，并可推广应用到其他生物大分子的识别检测中，在生物分析分离领域具有很高的应用潜力.