林 鸷，何锡忠，潘 洁，朱永军，彭丽英

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106)

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的急性传染病，临床特征为动物发热、奇痒及繁殖障碍，成年猪隐性感染从而造成长期带毒排毒等[1]。PRV基因组为GC含量高达70%以上的线状双链DNA，编码100多种蛋白。TK基因是猪伪狂犬病毒复制增殖的非必需基因，同时也是主要的毒力基因，对PRV毒力的影响最大，其编码的胸苷激酶参与病毒的复制和潜伏感染，对病毒在神经组织中的增殖具有重要作用[2-4]。

2011年以来，我国暴发了一种由猪伪狂犬病毒变异毒株引起的猪伪狂犬病，主要造成母猪繁殖障碍和初生乳猪死亡。接种传统的伪狂犬病疫苗已不能抵御伪狂犬病毒变异毒株的侵袭[5-6]。不同学者在不同的地区都分离到了流行的变异毒株[7-10]。本实验室也从发病猪脑中分离到了一株猪伪狂犬病毒，并命名为SX株，本试验拟利用PCR对该毒株的TK基因进行扩增和测序，并与国内外经典毒株、疫苗毒株以及近些年的变异毒株进行序列比对，以期了解猪伪狂犬流行变异毒株TK基因的结构特征及分子流行病学特点。

1 材料与方法

1.1 种毒、细胞

猪伪狂犬病毒SX株由上海市农业科学院畜牧兽医研究所分离所得。ST细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.2 主要试验试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；Ex Taq DNA 聚合酶、DL5000 DNA Marker等均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.3 引物设计

根据GenBank上已公布的序列设计针对TK基因的特异性引物，上游引物F：GCACCCCGAGGTTGACTTCA；下游引物R：AGGGTCACACCCCCATCTCC。扩增片段大小预计为1 125bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PRV DNA提取与PCR扩增

收集病变达到80%以上的ST细胞，反复冻融3次，12 000r/min离心后，取200 μL上清，利用试剂盒提取病毒DNA。利用1.3节的引物扩增PRV的TK基因。PCR反应体系：病毒DNA模板 2 μL，PCR mix 25 μL，上游引物F 2.5 μL，下游引物R 2.5 μL，ddH2O 18 μL，总体积50 μL。反应程序：95 ℃ 变性5 min； 95 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 个循环； 72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.5 序列分析

采用DNAStar软件将测序得到的SX株TK基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank上9株国内外PRV分离株的相应序列进行同源性比对分析和进化树分析。9株国内外分离株分别为来自中国的变异毒株HeN1株、JS2012株、TJ株、GD株、经典毒株Ea株，匈牙利的Kaplan株和疫苗毒株Bartha株，美国的Becker株以及希腊的Kolchis株。

2 结果与分析

2.1 PRV TK基因的扩增

用设计的特异性引物进行PCR扩增之后，产物在琼脂糖凝胶电泳上有一条特异性的条带，约1 100bp(图1)，大小与预期结果相符。

2.2 PRV TK基因核苷酸序列分析

PCR产物测序显示，目的片段包括了TK基因的编码区序列，长度为963bp，共编码320个氨基酸。将得到的序列结果与GenBank中已知的其他毒株TK基因核苷酸序列进行比对发现(图2)，SX株的TK基因序列与近些年国内分离得到的流行毒株TK基因序列同源性为100%；与经典毒株Ea株的同源性为99.6%，存在4个碱基的变异，分别为：第13位由A突变为C，第643位和第644位由A和C突变为G和T，第851位由C突变为T(图3)；与疫苗毒株Bartha株的同源性为99.7%，存在以下变异：第643位和第644位碱基由A和C分别突变为G和T，第851位碱基由C突变为T(图3)；与国外的Becker、Kaplan、Kolchis毒株的同源性分别为99.6%，99.7%和99.4%。与Becker毒株的同源性和Ea株相同；与Kaplan毒株相比存在3个碱基的变异：第57位T突变为G，第643和第644位由A和C突变为G和T；与Kolchis毒株相比存在5个碱基的突变：第163位G突变为A，第513位A突变为G，第643位和第644位由A和C突变为G和T，第810位A突变为G(图3)。

2.3 PRV TK基因编码的氨基酸序列分析

结果显示(图4)：SX株TK基因编码的氨基酸与近几年分离得到的流行毒株的TK基因编码的氨基酸同源性为100%。与国内经典毒株Ea株TK基因编码的氨基酸同源性为99.4%，存在2个氨基酸的突变(图5)：第215位的苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；与国外毒株TK基因编码的氨基酸同源性为99.1%—99.7%；与Bartha株、Becker株相比存在2个氨基酸的突变：第215位的苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；与Kaplan株相比只存在1个氨基酸的突变，即第215位的苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)；与Kolchis株相比存在3个氨基酸的突变(图5)：第55位的丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)，第215位的苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)，第293位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)。

利用DNAstar软件绘制进化树，从图6可看出，SX株与近些年国内分离得到的流行变异毒株在一个分支上，与国内经典毒株Ea株、疫苗株Bartha株以及国外其他毒株呈现各自独立的遗传进化分支。

3 讨论与结论

已有研究表明，TK基因属于PRV的早期基因，也是主要的毒力基因，TK基因虽然是PRV复制的非必需基因，但是对病毒在神经组织中的增殖具有重要作用。缺失了TK基因的病毒很难在神经元中增殖，同时也降低了病毒的嗜神经毒性和毒力[2-4]。因此，对TK基因的序列进行比对分析，在某种程度上可以反映出PRV的毒力强弱，有助于在分子水平上分析PRV 致病的分子机理。

本试验参考GenBank中已知的PRVTK基因及相近的序列，设计特异性引物扩增了TK基因的全长，测序显示TK基因的编码区为963个碱基，编码320个氨基酸。与国内外不同毒株比对显示，SX株TK基因序列与近些年分离到的变异毒株(HeN1、JS2012、TJ、GD)核苷酸和氨基酸均完全一致，同源性为100%；与国内经典毒株Ea株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%和99.4%；与国外的毒株(Bartha、Becker、Kaplan、Kolchis)核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.4%—99.7%和99.1%—99.7%。对比近些年国内流行的变异毒株TK基因与国内经典毒株及国外毒株TK基因氨基酸序列发现，存在的突变位点虽然不多，但是大部分都出现了第215位由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)和第284位由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)，这两个位点值得注意，可能这两个位点的突变是目前国内流行的变异毒株TK基因重要的分子特征之一。此外，TK基因有2个非常重要的结构域，即ATP结合结构域和核苷酸结合结构域，分别位于10—18位和108—110位[12]，这些核心区域都没有发生突变。由此可以看出，不管是核苷酸序列还是氨基酸序列，不同毒株之间存在一定的变异，但是同源性还是很高的，说明PRVTK基因具有较高的保守性。

本试验对PRV SX株的TK基因分子特征进行了初步的分析，可以为PRV分子流行病学调查、TK基因的功能研究及病毒基因组改造等提供参考。