韩晓然

[摘 要] 冬虫夏草是我国传统中药中的一种濒危物种。关于冬虫夏草及其无性型中国被毛孢的代谢已有很多研究报道，然而对于蝙蝠蛾幼虫人工接种中国被毛孢后的代谢变化却鲜有报道。本研究通过高分辨液质联用分析可准确判定人工培养物与天然冬虫夏草的成分差异，从而找出与天然冬虫夏草成分一致的培养物或僵虫，同时避免有害杂菌感染的样品用于替代天然冬虫夏草，从而扩大虫草药材的来源或找到更多、更安全的替代品，创造较大的经济效益，同时有利于保护野生虫草资源和生态环境。

[关键词] 冬虫夏草;中国被毛孢;子囊孢子;代谢组学;质谱全解析

[中图分类号] S567.35 [文献标识码] B [文章编号]1674-7909（2020）06--2

1 材料和方法

1.1 材料

3龄虫草蝙蝠蛾幼虫，采自四川省德阳县虫草基地，室内短期人工饲养。

采自青海玉树的天然冬虫夏草经人工诱导得到具有侵染能力的冬虫夏草子囊孢子。

1.2 方法

1.2.1 接种培养

本研究以子囊孢子悬液为接种體，每个处理20只蝙蝠蛾幼虫。考虑到蝙蝠蛾幼虫几天就蜕皮一次，而蜕皮可能对侵染不利，故本试验选择在进行浸蘸接种之后进一步采取穿刺接种法并同时将菌液混入幼虫食物中，从而增加侵染成功率。

1.2.2 接种后处理

接种后将幼虫放入事先编号的已灭菌的培养皿中，仅饲喂少量珠芽蓼，置于恒温培养箱中，于16 ℃、避光条件下培养。2 d后继续给予珠芽蓼并注意补充无菌水以保湿培养，5 d后转入土壤中继续饲养。每隔4 d检查统计幼虫死亡情况并加入少量珠芽蓼。珠芽蓼均要求进行紫外线照射灭菌消毒。

将侵染所得的死亡僵虫在显微镜下进行镜检观察后，置于冻干机中冷冻干燥后充入氩气保护，并放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 代谢组分析

1.2.3.1 样品的制备。将侵染所得的僵虫、野外采集的野生僵虫、天然冬虫夏草以及人工培养的中国被毛孢菌丝体同时进行冷冻干燥，之后分别将其置于研钵中磨碎备用;在进行代谢组分析之前准确称取磨碎后的样品各15 mg，加入1 mL甲醇提取液和Fmoc-glycine

（1 mg/mL）30 μL作为内标，涡旋30 s，25 ℃超声提取

1 h后于4 ℃冰箱中静置12 h。将提取物在1万r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液作为LC-TOF/MS待测样品。每组样品各做6组生物学重复，并以甲醇溶液作为空白组进行对照。

1.2.3.2 LC-TOF/MS条件。一是HPLC条件。色谱柱Agilent poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，30 mm×100 mm，

进样体积3 μl，柱温40 ℃，流速0.3 mL/min。就流动相而言，A相是含0.1%甲酸的水溶液，B相是含0.1%甲酸的乙腈溶液。

二是质谱条件。氮气作为干燥气体，氮气温度为350 ℃，流速为12 L/min，雾化气压35 psi;毛细管电压，阳离子4 000 V，阴离子3 500 V;碎裂电压，阳离子215 V，

阴离子170 V，锥孔电压60 V;质量采集范围，阳离子50～1 000 Da，阴离子50～1 100 Da。

1.2.3.3 代谢组数据分析。LC-MS采集的原始数据用MassHunter Software（Agilent Technologies，USA）的MFE运算进行自动峰检测和色谱去卷积，去除信噪比<

5的峰，提取出阴离子和阳离子的绝对峰高≥5 000的峰，并将每个样品的三维数据（出峰时间、相对分子质量和强度）导出保存。之后将导出的表格文件上传至MetaboAnalyst[1]进行峰对齐和滤噪处理，处理条件为质量偏差0.01 Da、时间偏差0.5 min，以阳离子（m/z）179.085 81、阴离子（m/z）364.079 66 为标准进行标准化，然后对数据进行Pareto Scaling处理。

1.2.3.4 代谢物识别。①通过数据处理分析得到的化合物，根据其质谱特征、精确质荷比和出峰时间等，利用MassHunter Qualitative Analysis Software初步确认其分子式;②在本实验室积累的虫生真菌天然产物数据库和网络数据库HMDB、METLIN上进行搜索匹配，以确定化合物的名称;③根据代谢物的洗脱顺序（极性）和结构性质对结果进行验证;④将代谢物的UV谱图与已知物质的标准谱图进行对照，以确定需要查找的差异化合物;⑤对于一些存在争议的代谢物质，尽可能使用标准品或者查阅相关昆虫病原真菌的代谢物报道进行验证。

2 结果与分析

2.1 人工侵染所得僵虫与天然冬虫夏草HPLC-TOF-MS全成分分析

2.1.1 HPLC-TOF-MS图谱比较。用HPLC-TOF-MS分别对通过子囊孢子悬液侵染所得僵虫与天然冬虫夏草的甲醇超声提取液中的化学成分进行定性分析比较。图1是抽取的子囊孢子悬液侵染所得僵虫的液质联用图。从图1可以看到，有些僵虫HPLC-TOF-MS图谱与野生冬虫夏草几乎完全一致，有些有明显差异。

2.1.2 人工侵染所得僵虫与天然冬虫夏草的化学成分鉴定。通过HPLC-TOF-MS检测得到僵虫与天然冬虫夏草中各化学成分的保留时间和质谱信息，并结合提取离子流图及与对照品、相关文献数据对比以及空白对照去除杂质，最终进行了化学成分的确认，根据质谱裂解特征鉴定的主要差异成分如下。

2.1.2.1 酵母氨酸。酵母氨酸tR为1.682 min的峰在ESI-模式下得到m/z为275.125 18的离子峰。绿僵菌中存在酵母氨酸，其分子质量为276.132 14。中国被毛孢中没有酵母氨酸的报道，而该僵虫（1-3）体内是否存在绿僵菌感染还需要进行进一步研究。

2.1.2.2 粉拟青霉素。粉拟青霉素tR为31.919 min的峰在ESI-模式下得到m/z为372.218 66的离子峰。粉棒束孢中存在粉拟青霉素，其分子质量为373.225 31。中国被毛孢中没有粉拟青霉素的报道，而该僵虫（1-4）体内是否存在粉棒束孢侵染还需要进行进一步研究。

在由子囊孢子悬液侵染所得的这组僵虫里，僵虫1-1和1-2与天然冬虫夏草相比差异不大，每个时间段都基本可以找到与天然冬虫夏草相对应的代谢产物。然而，僵虫1-3和1-4与天然冬虫夏草相比差异较为明显，可以看出部分代谢物只在僵虫中出现，如酵母氨酸、Cytochalasin C、粉拟青霉素、（R）-3-Hydroxybutanoyloxy-butanoate。通过查阅相关文献发现，这些物质属于某些与虫草相关的虫生真菌会产生的典型次级代谢产物，如粉棒束孢、绿僵菌等[2]。而1-3和1-4僵虫是否包含粉棒束孢、绿僵菌这两种真菌的混合侵染还需要进行进一步分析。总之，这些僵虫不能作为天然冬虫夏草的替代品。

3 结论

通过HPLC-TOF-MS全成分分析，可更直观和准确地比较差异，因此全图谱比较分析可作为研究冬虫夏草人工替代品的质量控制、方法。从分析结果来看，本研究中虽然发现子囊孢子悬液侵染蝙蝠蛾幼虫的成功率较高，但仍有明显杂菌污染，在大规模进行人工培养冬虫夏草及其替代品培养过程中，对于如何避免杂菌污染来确保虫草及其产品的真实性和高质量，仍需要进行深入研究。

参考文献

[1]Jianguo X，Nick P，Nelson Y，et al. MetaboAnalyst： a web server for metabolomics data analysis and interpretation[J].Nucleic Acids Research，2009（37）：652-660.

[2]胡丰林，李增智.虫草及相关真菌的次生代谢产物及其活性[J].菌物学报，2007（4）：607-632.