刘淑仙 吴春萍

摘要：以“利用DNA条形码调查校园昆虫多样性”课题为例，叙述了如何利用PCR及电泳技术开展高中生物研究性学习的具体实施方案。

关键词：DNA提取 PCR扩增 电泳 研究性学习

中图分类号：G633.91 文献标志码：A

研究性学习是指在教师的指导下，由学生从学习生活和社会生活情境中发现问题，选取课题，设计研究方案，通过主动的探索和研究，最终实现问题解决的学习过程。在高中阶段开展研究性学习是非常必要的。首先，研究性学习从根本上改变了过去传统的教学模式，真正做到以学生为主体：使学生在知识层面实现拓展与迁移;在过程上，增强了实践能力：在能力上提升了创新力，在情感上，增强了团队合作意识，在目标达成上提高了生物学学科核心素养。其次，研究性学习给教师的教学方式提出了新的要求。在教学过程中，教师不再是讲授者和演示者，而是学生的组织者、合作者、鼓励者和引导者。《普通高中生物学课程标准（2017年版）》（以下简称《新课标》）中提出“高中生物学课程要求让学生领悟生物学家在研究过程中所持有的观点以及解决问题的思路和方法，要求学生主动地参与学习，在亲历提出问题、获取信息、寻找证据、检验假设、发现规律等过程中习得生物学知识，养成科学思维的习惯，形成积极的科学态度，发展终身学习及创新实践能力”。因此，研究性学习是适应《新课标》理念的良好教学方式。

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少的DNA为模板在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。PCR实验教学是高中生物教学的重要组成部分。《新课标》提出“为帮助学生达成对选择性必修课程概念5的理解，促进学生生物学科核心素养的提升，应开展利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定教学活动”。PCR技术在科学研究领域应用非常广泛，如PCR技术可以获取目的基因用于基因工程，用于动植物、微生物及病毒的物种鉴定、遗传疾病的诊断、刑侦破案等。另外，基于科研论文的北京高考以及各区模拟试题中多有考查，因此，在高中阶段开展基于PCR技术的研究性学习是十分必要的。

电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。DNA分子带有负电，因此，在电场的作用下，DNA分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。利用DNA样品分子本身的大小，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现不同大小DNA分子的分离。下面利用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增成功与否进行鉴定。

1课程安排

本课以校本课程为平台，面向高一、高二学生开设。每学期初，学生根据兴趣选择课程。学生一般控制15人左右，课程实施时间为每周三和周四下午4：30-5：30。每学期18周，共36课时。

2教学实施过程

2.1理论学习先行

笔者利用5课时讲授相关基础知识，内容见表1。

2.2成，AN究性学习小组

研究性学习的组织形式采用小组合作研究，每组2-4人不等。学生自愿成组，在此形式下，学生可以相互启发，碰撞出更多的思维火花。另外，学生的合作精神也得到提高，学生可以学会交往、学会合作、学会尊重、学会理解他人的情感和意识。

2.3选定可操作性課题

研究性学习的开展，选题非常重要。切合实际、可操作性强的选题是成功的一半。在教学实施过程中，每个研究性小组组内成员可依据日常生活中的常见问题，讨论选定自己感兴趣的课题，最终通过师生共同讨论，摈弃不可操作的课题，选定可操作性的课题。笔者近几年开展了如下几个课题，分别是：利用DNA条形码调查校园昆虫多样性;探究不同种类水果中寄生果蝇的种类;利用DNA条形码鉴别市场上的真假羊肉等。下面以“利用DNA条形码调查校园昆虫多样性”课题为例进行详细介绍。

2.4样品采集

学生在校园内用捕虫网、扫网捕捉等采集昆虫。然后，将昆虫浸泡在无水乙醇中，或者放入加有乙酸乙酯的毒瓶中，带到实验室备用。采集标本后，学生要查阅文献、书籍等资料认识所采集的昆虫，可以借助学校图书馆，例如《中国动物志》《普通昆虫学》等，也可以借助网络资源，如中国知网、万方数据等，学习相关昆虫知识和研究背景，做好摘录。

2.5开展实验

2.5.1材料用具

主要实验器材：移液枪、电热恒温水浴锅、高速离心机、PCR扩增仪、电子天平、稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪、灭菌锅、1.5 mL离心管、0.2 mL的PCR管、样品冷冻盒。

主要实验试剂：（1）总DNA提取：使用Ezup柱式植物（动物）基因组DNA抽提试剂盒。（2）PCR相关试剂：DNA聚合酶（Takara）以及配套dNTP，10xPCR Buf-fer或者Easy Taq DNA聚合酶以及配套dNTP，10xBubfer，去离子水（ddH20），己合成的PCR引物。（3）电泳检测：琼脂糖，TAE电泳缓冲液（Tris醋酸40 mM，EDTA 2 raM）。核酸染料最好购买溴化乙锭（EB）的替代品，毒性小，以确保实验安全。

2.5.2总DNA提取

DNA提取方法使用DNA抽提试剂盒。DNA提取的步骤在试剂盒说明书的基础上做略微调整。主要调整步骤为：①生物组织的研磨方法，由于高中生物实验室没有组织研磨器，因此，将蓝色枪头在酒精灯上灼烧成一个圆头，待其冷却作为研磨头，将组织放入1.5 mL离心管中，进行手动研磨。②按照DNA提取试剂盒步骤加入缓冲液和蛋白酶K进行消化，消化时间根据组织的大小有所调整，一般在2～3 h之间。

2.5.3 PCR扩增

PCR扩增建议选用线粒体中的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因片段。该基因引物比较成熟，扩增成功率高。大多数的动物样品均可以使用通用引物LC01490和HC02198进行常规PCR扩增。正向引物序列LC01490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATYGG-3，反向引物序列HC02198 5-TAAACTFCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。PCR反应体系按照表2的各成分顺序加入PCR管中，需要注意的是最后加入Taq酶（-20°C保存），现加现取，加完后立即放回冰箱。每次加完一种成分需要更换枪头，以免造成样品污染。将所有样品加入PCR管后，用移液枪上下吸打混匀反应液，放入PCR扩增仪中进行扩增。

设置PCR仪的反应条件为：94。C预变性2mini 35个循环（94°C变性30 s，45～58°C退火1 min，72°C延伸1 min），72°c终延伸10 min。其中退火温度设定比较关键，可以按照引物Tm值的不同，设定不同的退火温度。退火温度越高，PCR扩增的特异性越好，成功率越低;退火温度越低，PCR扩增的成功率越高，但是特异性越差。用上述通用引物PCR扩增昆虫和羊肉的COI片段，选择53°C退火温度，扩增成功率很高。

2.5.4电泳检测

PCR是否成功使用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，具体操作如下。

①制胶：取0.2 g琼脂糖，放入250 mL的锥形瓶中，加入20 mL的1xTAE缓冲液混匀，将锥形瓶放入微波炉，加热溶解1min，待温度降至50～65°C左右（以手触可以承受）之后加入2uL核酸染料，倒入插有梳子的制胶板上备用。

②点样：室温下，待凝胶完全凝固后，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。注意点样孔应在电泳槽负极一侧，因为DNA带有负电荷，移动方向由负极移向正极。在电泳槽中加入lxTAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。取5uL产物，混入约1uL的Loadingbur-fer（电泳指示剂）染色，上样于点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

③电泳：接通电源，打开稳压稳流电泳仪，设置参数为稳压120V，稳流电泳400 mA，电泳时间20 min。点击启动按钮。

④结果观察：电泳结果在凝胶成像仪（紫外灯下）中观察。

在电泳过程中，教师一定要做好实验安全教育工作。虽然，本实验购买的核酸染料是适用于高中生的低毒试剂。但是仍然要严格要求学生带手套操作，强化安全教育，增强学生自我保护意识。同时，电泳后的琼脂糖凝胶需丢入实验废弃物垃圾箱，使学生形成实验废弃物要妥善处理的意识。

点样孔1的DNA Marker是由5条线状双链DNA条带组成，用于判断电泳中DNA条带长度的标准。图1中电泳图2、3、4、7点样孔条带长度大约是750 bp。与所要扩增的COI目的片段长度相符，初步可以判断这几个PCR样品扩增成功。5、6、8点样孔扩增失败。将扩增成功的PCR原液送生物公司测序。

2.5.5DNA序列分析

通过Seqman 5.01（DNASTAR，Inc.1996）进行双向测序结果的拼接。利用美國国立生物技术信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Informa-tion）、中国DNA条形码数据库等网上DNA序列数据库资源，进行序列比对从而达到物种鉴定的目的。或将NCBI中的相似性最高的序列下载下来，用软件MEGA 5.0中的Clustal W与待测样本DNA进行序列比对。此部分对于高中生来说较难操作，需要教师在课上指导完成，一般需要2周，共4课时。

2.6结果与分析

本研究通过将测序结果与NCBI数据库中己知物种的COI序列比对分析相似度高达99%以上。最终，鉴定出校园中7种昆虫（表2）。其余个体未在NCBI数据库中找到同种序列，但有近缘种，需要通过昆虫外部形态鉴定方法确定其分类地位，这也将是后续研究性学习要拓展的内容。

2.7撰写研究论文

每个研究小组的成果最终以研究论文的形式体现。教师用1课时讲授研究论文的书写内容、格式等要求，包括研究题目、摘要：、关键词：、研究背景、研究方法、结果与讨论、参考文献。学生按照书写要求撰写研究论文。此过程需要学生利用课上和课下时间综合完成，一般需要2周，共4课时。

2.8结题汇报

在课程最后一周的2课时，每个小组进行研究性学习结题汇报，作为本次课程的升华，汇报可以采用答辩会的方式，由学生和教师共同评价。此方式可以使各小组的科学研究的方法和成果在全体同学中交流推广，也激发了学生参与研究性学习的积极性和主动性。

3教学心得和感悟

PCR扩增和电泳技术属于现代分子生物学技术。如果教师只靠课堂上的理论讲解，学生很难深刻理解其含义。而通过研究性学习可以让学生充分理解这两项技术的基本原理和应用;本研究从分子水平分析不同物种的差异，让学生领悟到物种外部形态的差异源于其DNA分子的差异，从而建立个体水平和分子水平的联系。

在研究过程中，学生尊重实验和证据，运用科学的思维方法解决实际问题，如掌握了科学分析电泳图谱的能力。学生从身边昆虫入手，在探究过程中，逐步增强对自然现象的好奇心和求知欲，并且在研究中，乐于并善于团队合作，勇于创新，提升了科学探究的核心素养。学生鉴定出校园中存在多种多样的昆虫，进一步了解昆虫与周围环境的关系，认识到保护生物多样性的重要性，最终形成生态意识，自觉参与环境保护实践。