郑世浩，程琪，包永明

(大连理工大学海洋科学与技术学院，辽宁 盘锦 124221)

生态农业是新时代中国农业发展的核心。化学肥料虽然可大幅增加粮食产量和收益，但是土壤生态环境及可持续耕种问题迫切需要解决[1]。虽然中国出台农作物秸秆还田等鼓励政策，但是腐化时间长、病虫害等诸多技术障碍限制这一土壤生态工程的推广应用[2]。使用生物菌肥，不仅能降低或替代化学肥料的使用，而且可有效利用秸秆，减肥增效。

复合微生物菌肥中含有多类微生物。固氮菌具备生物固氮作用，即微生物经过体内的固氮酶将空气中的N2还原为NH3被植物直接利用，为作物的生长提供氮素[3]。释磷菌能将作物生长基质中难以利用的磷转化成可利用的形态，从而提高植物对磷的利用[4]。释磷菌分为释放不溶性无机磷细菌和水解有机磷细菌2种。释放不溶性无机磷细菌通过产生有机酸使难溶磷化物溶解；水解有机磷细菌则是通过酶的作用水解有机磷化物[5]。生防菌能以生物防治的方法来控制植物病原菌所导致的植物病害，芽孢杆菌自身能产生芽孢，且抗逆性较强，是一类常见的生防菌种[6-7]。

农林废弃物秸秆资源巨大，制备秸秆微生物菌肥实现秸秆还田是秸秆资源化利用的有效手段。甄静等[8]利用玉米秸秆，通过黑曲霉、枯草芽孢杆菌和毛栓孔菌发酵制备微生物菌肥，有效促进玉米秸秆的降解及土壤养分含量的提升；尹爽等[9]利用玉米秸秆发酵S-3菌株与白腐菌，使秸秆中的纤维素和木质素有效降解。目前，利用秸秆制备微生物菌肥多为秸秆高效降解，如何提高氮、磷营养成分以及防治病害等问题还未得到解决。本研究的微生物菌肥围绕秸秆有效资源化，不仅通过沼液厌氧处理以及里氏木霉腐化的方式使玉米秸秆高效降解，同时还通过固态发酵的方式使具有高效固氮、解磷、生物防治作用的菌株在玉米秸秆中大量生长，施用后能为栽培作物持续提供充足的氮、磷营养元素并对植物病害进行防治对策。在秸秆发酵过程中不添加任何化学试剂，资源化利用过程高效、易行，对环境友好，且成本低廉，更加具备实用价值。

本研究从植物根际土壤中分别筛选出具有高效固氮、释放不溶性无机磷和水解有机磷能力的菌株，将它们与能拮抗层出镰孢菌的甲基营养型芽孢杆菌混合，以秸秆为基质进行固态发酵，通过单因素试验和响应面法得到固态发酵营养体最高活菌数的适宜条件，制备出一种新型多效微生物菌肥。同时，利用制备的复合微生物菌肥栽培试验，通过对生长指标和抗病特性的测定，检验其应用效果。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究中菌种筛选所用土壤来自大连理工大学盘锦校区；玉米秸秆：沈阳市浑南区营城子街道；沼液：大连理工大学环境学院赠送；里氏木霉(Trichodermareesei)、层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)和甲基营养型芽孢杆菌KY2(BacillusmethylotrophicusKY2)：大连理工大学生物工程学院赠送。

实验仪器：酶标仪SpectraMax M2e(美国Molecular Devices)；全自动凯氏定氮仪VELP UDK 159(意大利VELP)；立式全温振荡培养箱ZQPL-200(天津莱玻特瑞仪器设备有限公司)；高压蒸汽灭菌锅SX-700(日本TOMY)；6202型小型高速粉碎机(北京开创同和科技发展有限公司)等。

培养基：① Ashby培养基(无氮源)：10.0g·L-1葡萄糖，0.2 g·L-1MgSO4·7H2O，5.0 g·L-1CaCO3，0.2 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KH2PO4，1.0 g·L-1CaSO4·2H2O，pH 7.0。

② Pikovskaya培养基：10.0 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1NaCl，0.3 g·L-1KCl，0.3 g·L-1MgSO4·7H2O，0.03 g·L-1MnSO4·4H2O，0.5 g·L-1(NH4)2SO4，5.0 g·L-1Ca3(PO4)2，0.03 g·L-1FeSO4·7H2O，pH 7.0。

③ 蒙金娜培养基：10.0 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1KCl，0.3 g·L-1NaCl，0.5 g·L-1(NH4)2SO4，0.03 g·L-1MnSO4·4H2O，0.3 g·L-1MgSO4·7H2O，0.03 g·L-1FeSO4·7H2O，2.0 g·L-1植酸钙，pH 7.0。

④ LB培养基：5.0 g·L-1酵母浸粉，10 g·L-1NaCl，10.0 g·L-1蛋白胨，pH 7.5。

⑤ PDA培养基：20.0 g·L-1葡萄糖，20.0 g·L-1马铃薯，pH自然。

制作琼脂培养基时需外加15 g·L-1琼脂。

1.2 固氮、释磷、生防菌株的筛选

将10 g土样添加至装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min-1条件下在立式全温振荡培养箱中恒温振荡培养2 h制备土壤悬液；按1%接种量，分别接种于100 mL Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min-1条件下在立式全温振荡培养箱中恒温振荡培养48 h，重复2次，进行富集培养。培养液梯度稀释后在Ashby培养基，蒙金娜培养基和Pikovskaya培养基的平板上分别接种0.1 mL的悬浮液，每组试验重复3次。培养5 d后，通过菌落的大小和形状在Ashby培养基筛选固氮菌[10-11]。通过在蒙金娜培养基和Pikovskaya培养基平板上产生透明圈大小，筛选释磷菌[12-13]。

根据平板对峙培养法，在PDA培养基中心点接种直径3 mm的层出镰孢菌，在周围距离45 mm处点接种生物防治菌株甲基营养型芽孢杆菌KY2，以无菌水处理作空白对照，每组试验重复3次，置于28 ℃恒温培养5 d，待对照组层出镰孢菌长满全部培养基时，测量抑菌直径评估拮抗效果[14]。

1.3 固氮、释磷能力的测定

将活化好的固氮菌、水解有机磷细菌、释放不溶性无机磷细菌分别接种至Ashby培养基、蒙金娜培养基和Pikovskaya培养基中，30 ℃、200 r·min-1恒温振荡培养120 h；每隔12 h，利用酶标仪SpectraMax M2e测定菌株发酵液的OD600，观察菌株的生长情况。

取1 mL固氮菌发酵液，利用全自动凯氏定氮仪VELP UDK 159测定总氮含量的变化[15]；取1 mL释磷菌发酵液，10 000 r·min-1离心8 min，取上清液，按照国标法(GB 11893—89—钼锑抗比色法)测定可溶性磷含量的变化。

1.4 菌种鉴定

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株DNA。PCR体系(50 μL)：DNA模板2 μL，正反向引物各1 μL，dNTP 4 μL，10× PCR 缓冲液5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 36.8 μL。PCR条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min 30个循环，72 ℃延伸10 min。将扩增产物送至北京华大基因公司测序，结果提交至NCBI数据库。

1.5 固态发酵条件优化

1.5.2 Central Composite Design 响应面设计试验 在单因素试验结果的基础上，选取温度、接种量、初始pH值为考察因素，有效活菌数为响应值，设计响应面试验。采用Design-Expert 10.0软件，确定温度、接种量、初始pH值的响应面试验因素水平和编码，以四种菌株的活菌数为指标设计20组试验。模型对有效活菌数进行二次多元回归拟合，得到响应面图，确定最佳发酵参数，同时，对该模型进行方差分析，检验其可信度[17]。

表1 单因素优化条件Table 1 Single factor optimization conditions

1.6 复合微生物菌肥指标测定

利用模型优化的发酵条件制备复合型生物菌肥，对预测结果进行验证；同时，按照农业行业标准NY/T 798-2015测定复合型生物菌肥的有机质、总氮、有效磷、总磷、pH、有效活菌数、杂菌率、有效期。

1.7 复合微生物菌肥烟草盆栽试验

1.7.1 复合微生物菌肥对烟草光合生理和基质营养成分的影响 依据栽种烟草土壤基质的不同设计5组试验：CK：珍珠岩57 g、泥炭土150 g；C0：珍珠岩19 g、泥炭土188 g；C1：珍珠岩57 g、泥炭土145 g，复合微生物菌肥5 g；C2：珍珠岩57 g、泥炭土140 g，复合微生物菌肥10 g；C3：珍珠岩57 g、泥炭土120 g，复合微生物菌肥30 g，每组试验重复5次。

试验处理：将烟草种子在育苗盘中培养14 d；选取粗壮的、生长状况较好的幼苗移栽入试验分组设计出的盆栽中，每组试验设置5组平行，每盆中均栽种长势一致的幼苗，生长40 d后，使用CIRAS2测定系统测定烟草盆栽在10：00时的净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(E)和胞间二氧化碳浓度(Ci)，连续重复3天。根据农业行业标准NY/T 798-2015测定盆栽基质中的有机质、总氮、有效磷、总磷和总有效活菌数。

1.7.2 复合微生物菌肥在烟草生物防治中的应用 依据栽种烟草土壤基质的不同设计4组试验：CK：泥炭土450 g；C1：泥炭土445 g，复合微生物菌肥5 g；C2：泥炭土440 g，复合微生物菌肥10 g；C3：泥炭土420 g，复合微生物菌肥30 g。每组试验重复5次。

试验处理：将烟草种子在育苗盘中培养14 d；选取粗壮的、生长状况较好的幼苗移栽入试验分组设计出的盆栽中，每组试验设置3组平行，每盆中均栽种长势一致的幼苗。生长40 d后时，观察烟草生长情况，然后接种层出镰孢菌，并于生长60 d时按照GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行了烟草层出镰孢菌枯萎病发病情况调查。发病率= (发病株数/调查总株数)×100%；病情指数=[∑(各级病株株数×该病级值) /(调查总株数×最高级值)]×100%；防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数) /对照病情指数×100%。

1.8 数据分析

固氮、解磷能力的表征实验所得数据利用Origin 2018进行制图。Central Composite Design设计试验采用Design-Expert 10.0软件，模型利用F检验进行显著性分析，显著水平为P<0.05。盆栽试验结果采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，Tukey法进行多重比对，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定结果

利用Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培养基富集筛选得到固氮菌N3、水解有机磷细菌Y1和释放不溶性无机磷细菌W3；16S rDNA测序将其分别鉴定为Arthrobactersp.ZSH N3(MN007137)，EnterobacterasburiaeZSH Y1(MN007138)，EnterobacterhormaecheiZSH W3(MN007139)(系统发育树略)。固氮菌N3、水解有机磷细菌Y1、释放不溶性无机磷细菌W3是首次报道，共同登录号为SUB5714815，在CGMCC的菌种保藏号分别为1.184 71、1.184 70、1.184 69。

2.2 固氮、解磷能力的表征

如图1A、1D所示，固氮菌N3在LB、无氮Ashby平板上生长状况良好，菌落呈黄色圆形；在Ashby液体培养基中生长20 hOD600值达到0.72，并且保持稳定，5天内的固氮量达到126.30 mg·L-1(图2A)。

A、B、C为LB培养基；D、E、F分别为Ashby，蒙金娜和Pikovskaya培养基。A,B,and C were LB media; D,E,and F were Ashby,Monkina,and Pikovskaya medium,respectively.

如图1B、1E所示，水解有机磷细菌Y1在蒙金娜平板上的溶磷圈直径可达22.5 mm。在液体培养基中生长24 hOD600值达到1.051，并且保持稳定，5 d内的溶磷量达到420.11 mg·L-1(图2B)。

如图1C、1F所示，释放不溶性无机磷细菌W3在Pikovskaya平板上的溶磷圈直径可达到18.0 mm。在液体培养基中生长36 hOD600值达到1.523，并且保持稳定，在5 d内的溶磷量达到513.19 mg·L-1(图2C)。

图2 菌株N3、Y1、W3固氮、解磷能力的测定Fig.2 Determination of nitrogen fixation and soluble phosphate-solubilizing ability of N3,Y1 and W3 strains

2.3 生防菌株的筛选

通过平板对峙法，如图3所示，甲基营养型芽孢杆菌KY2对于层出镰孢菌具有良好的拮抗效果。

A：对照组 层出镰孢菌单独生长7 d；B、C、D：试验组 KY2与层出镰孢菌分别共同生长1 d、4 d、7 d。接种在平板中央的为层出镰孢菌，两侧为KY2。A:CK group Fusarium proliferatum grew alone for 7 days.B,C,D:Experimental group KY2 and Fusarium proliferatum grew together for 1 d,4 d,and 7 d,respectively.Among them,Fusarium proliferatum was inoculated in the center of the plate,and KY2 strain was on the both sides.

2.4 固态发酵条件的优化

2.4.1 发酵条件的单因素分析 如图4所示，N3、Y1、W3和KY2这4株菌的适宜发酵温度、含水量和接种量分别为30～35 ℃、100%～120%和8%～12%；里氏木霉与4株菌的接种间隔时间的响应区间为24～36 h，4株菌活菌数随发酵时间的增加先快速上升最后趋于平缓，在发酵120 h后达到最大值，且保持稳定。实际发酵中可采用气相双动态固态发酵反应器，对发酵过程中温度、含水量、pH值、接种量进行实时调控[18]。

误差线表示标准差，线上字母表示同一菌株的有效活菌数在不同条件下的差异，P<0.05。The error bars indicate standard deviation,and the letters on the lines indicate the difference in the effective viable number of the same strain under different conditions,P<0.05.

2.4.2 响应面法优化固态发酵条件 在单因素试验结果的基础上，利用星点设计原理，在初始含水量100%、接种间隔24 h、发酵120 h的前提下，选择发酵温度A、接种量B和初始pHC3个因素为自变量，以N3、Y1、W3和KY2的有效活菌数对数值为指标R1、R2、R3、R4，具体方案及结果如表2所示。

响应面设计数据分析应用Design-Expert 10.0对表1中的数据进行二次多元回归拟合,得到发酵温度、接种量和初始pH与N3、Y1、W3和KY2的有效活菌数对数值之间的二次多元回归方程，分别为：

R1=9.35-0.009 5A+0.011B-0.006C-0.009AB-0.005 5AC-0.001 25BC-0.003 25A2-0.014B2-0.011C2，

R2=9.44-0.021A+0.036B+0.006 7C+0.006 9AB+0.001AC-0.008BC-0.013A2-0.005 3B2-0.003 2C2，

R3=8.85-0.022A+0.024B-0.003 337C-0.002 1AB-0.014AC+0.003 9BC-0.029A2-0.031B2+0.023C2，

R4=9.45-0.017A+0.029B-0.001 6C-0.002 1AB-0.013AC+0.003 4BC-0.015A2-0.005B2-0.007 8C2。

回归方程系数r1=0.951 8、r2=0.952 2、r3=0.948 2、r4=0.953 1，校正决定系数r1adj=0.908 3、r2adj=0.909 1、r3adj=0.901 6、r4adj=0.910 9，r>0.9说明该模型能精准的预测实际情况，radj>0.9说明该模型拟合程度较好，且预测值和实测值间具有高度的相关性，因此上述模型合理可用。

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。4组回归方程模型显著性检验均P<0.000 1，模型回归极显著，具有可信度。

根据回归方程，通过Design-Expert 10.0软件分析，得到回归模型存在最大值点，即3个影响因素的最佳取值为温度30.4 ℃、接种量15.5%、初始pH值为7.8时，N3、Y1、W3和KY2有效活菌数最大估计值分别为2.20×109、2.92×109、7.19×108和3.02×109CFU·g-1。

2.5 复合微生物菌肥指标的测定

根据响应面预测出的发酵条件：温度30.4 ℃、初始pH 7.8、初始含水量100%、接种量15.5%、接种间隔时间24 h、发酵时间120 h，对产品进行验证。由表4所示，N3、Y1、W3和KY2的实际活菌数分别为2.27×109、3.11×109、7.10×108和3.21×109CFU·g-1，实际值与预测值基本吻合。

表2 Central composite design试验结果 Table 2 Experimental results of Central composite design

表3 响应面回归模型F检验效应分析Table 3 F-test effect analysis of response surface regression model

续表Continuing table

表4 复合微生物菌肥的产品分析Table 4 Product analysis for multi-effects microbial fertilizer

2.6 复合微生物菌肥对栽培烟草光合作用的影响

烟草栽培40 d时，C2组的烟草叶片的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率显著高于其他试验组，胞间二氧化碳浓度显著低于其他试验组(表5)。说明复合微生物菌肥能促进烟草的光合作用，在土肥比为15∶1时，烟草叶片处光合速率最高，烟草的光合作用最强，生长情况最佳。

表5 栽培烟草光合作用指标Table 5 Photosynthetic index of cultivated tobacco

2.7 复合微生物菌肥对盆栽基质营养成分的影响

由表6可知，本研究中C2、C3处理的盆栽基质中第40 天时总有效活菌数可达到7.9×107CFU·g-1和1.12×108CFU·g-1，显著高于未添加复合微生物菌肥的CK、C0处理。通过平板计数中菌落形态得知，本研究复合微生物菌肥中所含有的多功能菌株能够协同生长，并作为优势菌群进一步发挥作用。复合微生物菌肥显著增加盆栽基质中的氮和磷的含量，C3处理的盆栽基质中的总氮、总磷和有效磷分别增加了0.9%、0.42%和0.23%，显著高于CK、C0；C2处理的盆栽基质在栽培前后总氮和有效磷分别增加了0.56%和0.22%，验证了除复合微生物菌肥自身富含的氮、磷营养元素外，复合微生物菌肥中含有大量微生物还能在自身生长代谢过程中为植物提供养分。

表6 盆栽基质营养成分分析Table 6 Nutrients analysis of pot experiment soil

2.8 复合微生物菌肥在烟草生物防治中的应用

由表7可知，60 d时不同处理下的烟草对层出单胞菌的防治效果，对照组CK的全部发病，试验组C3的发病率最低(10%)，防治效果达到了91.17%。

表7 栽培烟草的层出镰孢菌枯萎病的防治效果Table 7 Control effect of Fusarium proliferatum wilt on cultivated tobacco

3 结论与讨论

3.1 固态发酵制备复合微生物菌肥的优势

微生物菌肥产品的制备方法分为液态发酵和固态发酵，液态发酵的优势主要包括发酵设备完善，自动化程度高，产品稳定性好，芽孢存活率较高等；缺点是动力消耗大，非芽孢菌活性低，储存期端，原料要求高。固态发酵具备液态发酵所不具备的特点，如发酵过程中消耗的资源量少，对环境友好，废弃物利用率高，多菌种混合菌株产品的存活率高，对发酵设备需求低等等。随着水资源的节约力度日益增加，以及国家对生态环保的日渐重视，固态发酵理应成为菌肥制备的首要选择。李玉洋等[19]采用菌糠为原材料固态发酵多粘类芽孢杆菌SH15，144 h时活菌数可达5.02×109CFU·g-1；秦宇轩等[20]对优化了解淀粉芽孢杆菌L-H15的固态发酵工艺，144 h时最大活菌数可达1.68×1010CFU·g-1；王攀等[21]利用餐厨垃圾废液液态发酵圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌的方法制备微生物菌剂，有效活菌数最高可达2×108CFU·g-1。相比较而言，固态发酵的发酵效果更佳。

本研究筛选得到固氮菌N3(Arthrobactersp.ZSH N3)、水解有机磷细菌Y1(EnterobacterasburiaeZSH Y1)、释放不溶性无机磷细菌W3(EnterobacterhormaecheiZSH W3)均是新报道的功能菌株，混合培养不拮抗，表现出良好的中性同生或互生关系；以玉米秸秆为主要原料建立优化的混合固态发酵工艺，每克复合菌肥产品中3种细菌有效活菌数都在109以上，高于国家标准近3个数量级，达到目前研究范围内的较高水平；同时，复合微生物菌肥产品还具有功能多元化的特点，菌肥中总氮和有效磷含量分别为原材料的6.07倍和11.43倍，不仅固氮、释磷功效强，还兼具生物防治作用，体现了固态发酵工艺优势，也可扩展应用到其他固体废弃物原料，可进一步进行产业化推广[22]。

3.2 复合微生物菌肥对盆栽基质营养成分的影响

张迎春等[23]研究了微生物菌肥对莴笋及土壤性质的影响，土壤中的有机质随微生物菌肥的增加而增加，充分施用微生物菌肥后土壤总氮增加了0.8%，土壤总磷增加了0.65%，土壤有效磷增加了0.13%。本研究制备的复合微生物肥料中有机质含量为56.63%，使用后极大提高盆栽土壤基质中有机质的含量，并作为营养物质供固氮菌、释磷菌、生防菌等微生物进行生长代谢，持续提高复合菌肥功效。

周登博等[24]通过盆栽接种试验探究了甲基营养型芽孢杆菌在香蕉根际土壤的定殖能力，接种第10 d活菌数最大值为6.67×106CFU·g-1，25 d后活菌数为2.05×106CFU·g-1，趋于稳定。微生物的定殖能够增进盆栽基质中团状结构的产生，延缓肥料中营养物质的溢出，从而增进基质的保肥保水性，减少氮的损失。复合微生物肥料含有大量的固氮、解磷微生物，固氮菌能以生物固氮的方式为作物提供氮素，解磷菌可在基质营养供给不足时加速难溶磷元素的活化[22]。复合微生物菌肥可以显著增加盆栽基质中的有机质、总氮、有效磷，能进一步生成和分解基质中的营养物质和有效成分，固定更多氮素，并将基质内难溶的磷分解，供植物吸收[23]。

本研究制备的复合微生物菌肥，不但含有大量有机质，改善土壤基质的营养成分，而且菌肥中的多功能菌株能够互相协同，组合成优势菌群大量定殖，持续发挥固氮、释磷、生防功能，盆栽烟草试验证明，复合微生物菌肥能够显著促进烟草生长，显著增加盆栽土壤基质中的营养成分含量以及总有效活菌数，效果显著，具有较高的应用价值。

3.3 复合微生物菌肥在烟草生物防治中的应用

层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)是一种可引起土传多种植物枯萎病的重要病原菌[25]。目前，利用生物防治技术应对层出镰孢菌植物病害的研究日益完善，汪军等[25]研究出枯草芽孢杆菌BLG010对病原尖孢层出镰孢菌FOC的最大抑菌率达到71.08%；殷晓敏等[26]研究出的甲基营养型芽孢杆菌XG-1对西瓜层出镰孢菌枯萎病的防治效果可达90%。甲基营养型芽孢杆菌既可以通过分泌几丁质酶、抗菌蛋白等产物与病原菌拮抗，还能诱导植物自身产生过氧化氢酶、多酚氧化酶等抗性物质，是一种良好的生防菌[24-26]。

本研究制备的复合微生物菌肥对层出镰孢菌引起的烟草枯萎病防治效果可达91.17%，甲基营养型芽孢杆菌KY2在盆栽基质中的定殖起到了重要的作用。

综上，玉米秸秆固态发酵制备复合微生物菌肥是秸秆资源化利用的有效途径，施用复合微生物菌肥既能有效提高栽培土壤基质的营养成分含量、改善盆栽基质的微生物群落结构，促进烟草作物的生长及光合作用；同时，可有效防治烟草层出镰孢菌枯萎病。