潘 健， 卢晓燕， 程家寿， 房 震， 刘抗旱

(1.黄山学院生命与环境科学学院， 安徽 黄山 245041； 2.祁门县查湾森工采育场， 安徽 黄山 245609)

永瓣藤(MonimopetalumchinenseRehd)是我国特有的二级保护珍稀树种，隶属卫矛科(Celastraceae)永瓣藤属，为单型属植物，因其花瓣宿存在果实上不凋落，故名永瓣藤。模式标本采于安徽省祁门县潘坑坞，目前仅残存于安徽西南部、江西北部景德镇、湖北通山和浙江金华沙畈乡海拔200～900 m的狭窄山谷、沟边或山坡林中，且分布区域正呈逐渐缩小趋势[1-3]。由于它的分类位置孤立，因此在研究卫矛科系统演化上具有重要的意义[4]。永瓣藤在江西民间常用于治疗风湿性关节炎[5]，近年来对其茎叶化学成分研究表明，永瓣藤含有大量的药用成分，具有潜在的药用价值，在医学、营养学上有具有很高的研究意义[6-11]。其叶色四季变化明显，秋冬季叶片开始转为紫红色或黄色，经冬不落，直到翌年早春新芽萌发后始渐落，具有较高的观赏价值，可开发用于垂直绿化和盆景树种。因此，永瓣藤是一类集观赏、药用、科研于一体，具有极大开发潜力的珍稀物种。但自然条件下的永瓣藤结实率低，落花落果和败育现象很普遍，种皮的极度石化或骨质化，使种子萌发困难[4]，严重阻碍其保护和进一步开发的进程。目前，国内学者主要从地理分布、群落学、种群生态学、分子生物学等[1,12-16]方面对永瓣藤致濒原因进行了探讨，并取得了一定进展，但对永瓣藤种子生物学方面的基础研究仍十分欠缺。

种子生活力是种子质量的一项重要指标[16]，它能衡量种子发芽的潜在能力，通常采用发芽试验方法测定[17]。在适宜的环境条件下，有生活力的种子都能够萌发[18]。由于永瓣藤种子存在休眠现象，所以常规的发芽测定方法不能很快检测种子质量状况，而四唑(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，TTC)法是目前公认最为有效的快速测定种子生活力的方法[19-20]，并且不受种子休眠的限制[21]。因此，本试验采用TTC染色法研究永瓣藤种子生活力的快速测定条件，为确定种子发芽潜力、评定种子质量及探讨永瓣藤有性生殖的濒危机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

永瓣藤种子于2014年10月采自安徽省祁门县牯牛降自然保护区(30°01′110″N，117°30′765″E)，净种后冷藏备用。

1.2 试验方法

参照ISTAF(国际种子检验协会)种子检验规程[22]，于2015年3月采用四唑(TTC)染色法测定永瓣藤种子生活力。

1.2.1正交试验设计

为确定永瓣藤种子生活力测定的最佳条件，本实验采用了3因素3水平的正交试验L9(34)设计法比较染色时间、TTC溶液浓度、TTC溶液pH值等因素对种子生活力的影响(表1)。

注：A为煮死胚染色；B为胚根处染色；C为胚染成浅红色；D为胚染成红色。

表1 正交试验因素水平

水平因素A(染色时间/h)B(TTC浓度/%) C (pH值)120.16.5230.57.0341.07.5

1.2.2种子预处理

用蒸馏水浸泡永瓣藤种子24 h，待种子充分吸收水分后，取出种胚，置于培养皿中备用。培养皿中放有湿润的滤纸，防止种胚缺水而失去生活力。每处理3次重复，每重复30个种胚，对照为煮沸失活的永瓣藤种胚。

1.2.3TTC溶液的配制

用蒸馏水分别配制pH值为6.5、7.0、7.5的磷酸缓冲液各200 mL，再用不同pH值的磷酸缓冲液溶解相应质量的红四啖唑，配制成质量分数分别为0.1%、0.5%、1.0% 的TTC溶液。

1.2.4种子生活力染色观察

将染色的种胚冲洗干净后在光学显微镜下观察并拍照，记录染色情况。判断种子生活力的标准参考ISTAF(国际种子检验协会)种子检验规程[22]：胚的主要组织染成粉红色或红色即为有活力种子，仅胚根染色或未染成颜色为无活力种子。

染色率(%)=(染色数/种子总数)×100%。

1.3 数据处理

用Excel 2010、SPSS 17.0软件进行数据分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 永瓣藤种子染色率极差分析

永瓣藤种胚染色主要出现4种状态(图1)。试验结果(表2)表明，处理3(2 h染色时间、1.0% TTC溶液浓度、pH=7.5)染色率最高，为94.4%，观察结果也说明该处理的染色效果最明显，而且染色均匀(图1-D)。处理1(2 h染色时间、0.1%TTC溶液浓度、pH=6.5)染色率最低，为47.8%，胚及子叶染色比较浅，呈浅红色(图1-C)，还有部分胚只有胚根染色，子叶未染色(图1-B)。

表2 各处理永瓣藤种子染色结果

处理ABC染色率/%111147.8±5.1212285.6±5.1313394.4±3.8421277.8±3.8522377.8±1.9623187.8±3.8731362.2±1.9832181.1±1.9933292.2±1.9

极差值(R)的大小可以判断各因素影响作用的大小，R值越大，说明该因素对该指标的影响越大。由图2可知，TTC溶液浓度R值最大(28.9)，其次为TTC溶液的pH值(13.0)，染色时间的R值最低(5.2)，因此各因素对永瓣藤胚染色率影响的主次因素为B>C>A，最佳组合为A2B3C2，即将永瓣藤胚放入pH=7.0，浓度为1.0%TTC溶液中浸泡3 h，染色效果最好。

2.2 永瓣藤种子染色率方差分析

极差分析可以简单直观的反映试验结果，但不能反映其误差大小和精度，因此，还需进行方差分析。不同试验因素和水平下的胚染色率方差分析的结果显示(表3)，TTC溶液浓度和pH值对染色率有极显著影响(p<0.01)，染色时间对染色率有显著影响(p<0.05)，各因素对染色率影响的主次因素依次为B>C>A，这与极差结果一致。多重比较的结果(图2)表明，染色处理2 h与3 h差异显著，但与染色处理4 h差异不显著，染色处理3 h与4 h差异不显著；TTC浓度、pH值各因素各水平两两之间差异均显著，其中1.0% TTC溶液的染色率最高，为91.5%。

图2 染色率与各因素和水平的关系

表3 永瓣藤种子染色率的方差分析

方差来源偏差平方和自由度均方F显著性A0.01220.0065.0690.020*B0.38820.194162.9320.000**C0.07620.03831.8630.000**

注：“**”表示试验因素在p<0.01水平上差异极显著，“*”表示试验因素在p<0.05水平上差异显著。

3 结论与讨论

本试验中，染色率最高的为处理3，即pH=7.5、浓度为1.0%的TTC溶液避光染色2 h，此组合胚的染色效果较好，呈均匀的鲜红色或红色。极差分析表明，pH=7.0、浓度为1.0%的TTC溶液避光染色3 h为最优组合。方差分析显示，染色3 h的染色率显著高于2 h处理，pH=7.0的染色率显著高于pH=7.5处理。综上所述，永瓣藤种胚TTC染色的最佳处理组合为A2B3C2，即pH=7.0、浓度为1.0%的TTC溶液避光染色3 h。

经TTC法测定，冷藏半年永瓣藤饱满种子的生活力高达94.4%，与靛蓝染色测定其种子生活力结果相似[23]，但与谢国文[24]研究结果相反，究其原因可能与种子贮藏方式有关。孙维敏等[25]用外源赤霉素处理冷藏1年的永瓣藤种子做发芽试验，其发芽率最高可达88.5%，间接证明本试验用四唑法测永瓣藤种子生活力结果的可靠性。谢国文试验中显示经TTC测定，干燥贮藏半年的种子几乎全部丧失活力，说明永瓣藤种子生活力在不适宜环境条件下会下降很快，低温冷藏有利于种子保持较长活力[26]，可见温度是限制永瓣藤种子保存的重要生态因子。

种子是植物进行有性生殖的重要器官之一。大多数的植物依靠有性繁殖产生后代而使物种延续[27]。在自然界中，永瓣藤主要是依靠匍匐茎和根系萌芽产生新植株进行种群更新[1,28]。群落调查表明野外几乎难见实生苗，也从另一个角度说明永瓣藤很难依靠土壤种子库中储藏的种子，产生一定数量的幼苗，为林分的自我更新创造条件。虽然成熟永瓣藤种子具有较高生活力，内在的发芽潜力很大，但萌发率极低，可见并不是因为永瓣藤种胚活力低，而是因为永瓣藤种子具有休眠特性[23]。种子结实率低[24]、种子具休眠特性[23]，极大限制了永瓣藤有性繁殖，另一方面永瓣藤种子在干燥环境下极易丧失生活力[24]，很难形成持久的土壤种子库，加上环境对种子、幼苗的筛选淘汰，这些因素可能是导致其濒危的主要内在原因。

测定种子生活力是检验种子质量高低的一项可靠指标[29]，本研究摸索出离体胚直接染色测定永瓣藤种子生活力，具有快速、准确，不受种子休眠限制的特点。