赵浩晨 王婉婷 雷佳美 徐艳

摘要：以银杏果肉质外种皮为原料，采用水提醇沉法提取其水溶性多糖。以过氧化氢为脱色剂，多糖脱色率和保留率为指标，脱色时间、脱色温度、pH值和过氧化氢体积分数为试验因素，进行单因素试验，以确定影响脱色的因素及其水平，采用L9（34）正交设计进行优化试验。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、还原力测定法对多糖进行抗氧化活性检测。结果表明，脱色温度为 60 ℃，脱色时间为1 h，pH值为8，过氧化氢加入量为8%时脱色效果最佳。抗氧化测定结果表明，银杏外种皮多糖具有良好的抗氧化活性，脱色后抗氧化活性略有降低。

关键词：银杏果;外种皮;过氧化氢;脱色;多糖;抗氧化活性

中图分类号： R284.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0228-04

收稿日期：2019-04-09

基金项目：沈阳农业大学大学生科技创新項目（编号：201810157338）。

作者简介：赵浩晨（1996—），男，辽宁抚顺人，主要从事生物工程研究。E-mail：99644880@qq.com。

通信作者：徐 艳，博士，讲师，主要从事天然产物活性研究。E-mail：1472105886@qq.com。

银杏（Ginkgo biloba L.）果，俗称白果，其营养非常丰富，在许多国家和地区均有大量分布，自古以来被当作营养丰富的高级滋补品[1]。目前，对银杏叶和果的研究已取得了很多进展[2-4]，但对银杏果果外种皮的研究还较少。银杏果外种皮是银杏种子硬壳外面的肉质部分，长期以来被作为废物丢弃，既浪费了资源，又污染了环境[5]。据统计，我国每年约有3万t外种皮作为废物被丢弃。近几年的研究表明，银杏外种皮具有多方面药理活性，有较高的利用价值[6]。银杏外种皮含有多种化合物，包括多糖、酚酸、黄酮、银杏内酯等[7-9]。其中，多糖含量最高，且具有抗氧化、抑菌、增强免疫力等多种生物活性[10-11]。

然而，银杏外种皮经过水提醇沉后得到的多糖呈现深褐色，色素属于杂质性物质，会阻碍多糖的进一步分离纯化，并阻碍作用机制等方面的研究。因此，有必要对多糖进行脱色。过氧化氢脱色法是利用过氧化氢在水溶液中可电离出过氧化氢根离子（HO-2）与发色基团作用，使得发色基团被破坏而起到脱色作用，该方法具有脱色后不易复色的特点，主要适用于色素多且含有不饱和双键、羟基和芳香环的物质[12-13]。但H2O2也可能造成多糖的氧化或破坏，因此结合多糖保留率指标来筛选出H2O2的更优水平。

本研究采用过氧化氢进行氧化脱色，以多糖脱色率和保留率为评价指标，在单因素试验的基础上采用正交试验优化脱色工艺，并研究脱色前后多糖的抗氧化活性。

1 材料、试剂与仪器

材料：银杏果，2018年10月采自沈阳农业大学校园，去核，于-70 ℃冰箱中冻存备用。

试剂：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，A Johnson Matthey Company）;体积分数为30%的过氧化氢以及葡萄糖、浓硫酸、蒽酮等试剂均为国产分析纯。

仪器：UV-2100型分光光度计[龙尼可（上海）仪器有限公司];HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）;

2 试验方法

2.1 银杏果外种皮多糖的提取

称取银杏果外种皮200 g，将其用匀浆机打成浆，采用乙醇回流法去除其中的脂溶性物质，将剩余滤渣用水煎煮法提取水溶性多糖，提取2次，每次2 h，合并滤液。采用Sevage法对粗多糖水溶液进行脱蛋白处理。用三氯甲烷 ∶ 正丁醇为4 ∶ 1的混合液反复萃取多糖水溶液，直至中间白色蛋白层消失为止。将脱蛋白后的多糖水溶液用3倍量乙醇进行沉淀，静止过夜，用乙醇抽洗至干。

2.2 过氧化氢对银杏外种皮多糖进行脱色的工艺研究[14]

选择过氧化氢为脱色剂，以脱色时间、脱色温度、pH值和过氧化氢体积分数为试验因素，进行单因素试验，以确定脱色影响因素及其水平，采用 L9（34） 正交设计进行优化试验，以多糖脱色率、保留率为考察最佳脱色工艺的指标。多糖含量的测定采用硫酸-蒽酮法。

多糖脱色率=（D1-D2）/D1×100%;

（1）

多糖保留率=M后/M前×100%。

（2）

式中：D1、D2分别为多糖溶液在脱色前、后的吸光度;M前、M后分别为多糖溶液在脱色前、后的多糖含量。

2.2.1 脱色的影响因素及其水平的确定[15] 准确移取多糖溶液，考察过氧化氢加入量（4%、6%、8%、10%、12%）、脱色时间（0.5、1、2、3 h）、pH值（8、9、10、11）、脱色温度（40、50、60、70 ℃）4个因素对多糖脱色率的影响。

2.2.2 正交试验设计

2.2.2.1 正交试验因素与水平设计 在单因素试验基础上，进行正交试验，正交试验因素与水平设计详见表1。

2.2.2.2 正交试验 采用L9（34）正交设计进行试验。

2.3 银杏外种皮多糖的抗氧化活性测定

采取提取物与稳定自由基DPPH反应的分析方法考察多糖对DPPH自由基的清除率[16]，采用铁离子还原法（FRAP）和铁氰化钾还原法来测定多糖的还原性[17]。

3 结果与分析

3.1 脱色的影响因素及其水平的确定

3.1.1 过氧化氢加入量对脱色的影响 由图1可知，随着H2O2加入量的增加，多糖脱色率提高。H2O2加入量由4%增加到6%时，脱色趋势平缓，多糖脱色率增加3.0百分点。H2O2加入量由6%增加到10%时，多糖脱色率增加7.5百分点，超过10%，多糖脱色率变化不大。因此，考虑脱色效果及成本，选择6%、8%、10% 3个水平的H2O2加入量进行正交试验。

3.1.2 脱色时间对过氧化氢脱色的影响 由图2可知，在脱色时间0.5～2.0 h内，脱色率随脱色时间的增加而上升，然后脱色趋势平缓，因此，考虑选择1、2、3 h共3个水平的脱色时间进行正交试验。

3.1.3 pH值对过氧化氢脱色的影响 由图3可知，当pH值由8增加到9时，脱色率快速升高。但当pH值超过10后，脱色率增幅不大。因此，选用pH值8、9、10共3个水平进行正交试验。

3.1.4 脱色温度对过氧化氢脱色的影响 由图4可知，当脱色温度由40 ℃升到50 ℃时，脱色率略有提高。但当脱色温度超过50 ℃时，脱色率反而下降。因此，选用40、50、60 ℃ 3个水平的脱色温度进行正交试验。

3.2 正交试验结果

由表2可知，各因素对脱色率的影响程度依次为C>D>B>A，各因素对多糖保留率的影响程度依次為D>C>A>B。各因素对脱色率与保留率乘积的影响程度依次为C>D>B>A。k值显示，各因素最优水平为A3B1C1D2，即脱色温度为60 ℃，脱色时间为1 h，pH值为8，过氧化氢加入量为8%。

3.3 脱色对银杏外种皮多糖抗氧化活性的影响

3.3.1 对DPPH自由基清除活性的影响 由图5可知，随多糖浓度的增加，银杏外种皮多糖对DPPH自由基清除活性增强。脱色后多糖清除DPPH自由基活性略有下降，但变化不大。

3.3.2 对多糖还原力的影响 由图6可知，随多糖质量浓度的增加，银杏外种皮多糖还原力增强。脱色后多糖还原力略有下降，但变化不大。

4 结论与讨论

以过氧化氢为脱色剂，采用单因素试验和正交试验对脱色条件进行优化，得到最佳工艺条件为脱色温度60 ℃，脱色时间1 h，pH值8，过氧化氢加入量8%。用过氧化氢对银杏外种皮多糖脱色，工艺简单，多糖保留率高。多糖脱色后抗氧化活性略有下降，但变化不明显。

目前常用的多糖脱色方法有活性碳脱色法、过氧化氢氧化脱色法。但活性炭吸附色素的同时，多糖损失也较多，而且后期过滤较为困难。过氧化氢脱色现象明显，多糖保留率高，虽然过氧化氢脱色会使多糖部分氧化，活性略有降低，但仍不失为一种简单、可行的脱色方法。

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