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利用非靶向代谢组学方法研究龙胆泻肝汤治疗急性肝损伤的机制

2020-07-06张艳王爽李永哲宋爽

江苏农业科学 2020年10期
关键词:代谢组学气相色谱质谱

张艳 王爽 李永哲 宋爽

摘要:以龙胆草、黄芩、山栀子、生地黄、泽泻、车前子、当归、木通、柴胡和甘草组成的龙胆泻肝汤为试材,采用气相色谱-质谱技术,并结合代谢组学的方法研究龙胆泻肝汤对大鼠急性肝损伤(ALI)的治疗作用及机制。结果表明,龙胆泻肝汤有明显的治疗ALI的作用,其机制与影响丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-别苏氨酸、4-羟基脯氨酸、柠檬酸和吲哚乳酸8个具有特征性的内源性生物标志物有关,这些标志物属于三羧酸循环,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙酮酸代谢和糖酵解或糖异生5个代谢途径。龙胆泻肝汤能改善ALI大鼠的症状,调节ALI大鼠代谢通路异常,具有明显的保肝作用。

关键词:龙胆泻肝汤;急性肝损伤;标志物;代谢组学;气相色谱-质谱

中图分类号: R285.5  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2020)10-0208-06

收稿日期:2019-04-17

基金项目:吉林省教育厅科学技术项目(编号:JJKH20190825KJ);吉林市科技创新发展计划(编号:201831779)。

作者简介:张 艳(1981—),吉林吉林人,博士,副教授,主要从事药理学和代谢组学研究。E-mail:zhangyan@jlict.edu.cn。

龙胆泻肝汤是我国的传统中药复方方剂,由龙胆草、黄芩、山栀子、生地黄、泽泻、车前子、当归、木通、柴胡、甘草组成,最早由汪昂在《医方集解》中提出,主要用于治疗肝胆实火上炎症[1]。现代药理学研究表明,龙胆泻肝汤具有调节免疫[2-3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、镇痛[7],调节消化系统功能[8]等作用。此外,黄芩、山栀子等中草药形态优美,花朵秀丽,将中草药种植用于园林绿化工程中,既节省了苗木投入,又可以从药材种植中获得一定的经济收益,具有较高的园林开发价值。

我国传统的中药方剂是以多味中药协同的形式组成的复方制剂,倡导联合用药以及整体性。根据传统中医理论,中药方剂以每味中药的有效成分协调发挥药理作用的形式治疗疾病,“整体大于部分之和”是方剂作用的基本特征[9]。代谢组学是20世纪末发展起来的一门新兴技术,它借助于现代的分析手段,通过考察生物体系受疾病扰动后其代谢产物的变化,系统地揭示疾病的发展过程和分子机制[10]。其整体性的特点与中医理论不谋而合,因此代谢组学可以为中药方剂复杂的作用机制研究提供新方法,对于提高其临床疗效和安全性,促进中医药的进一步发展具有重要意义[11]。

急性肝损伤(ALI)是一种源于病毒性肝炎、药物诱导、乙醇、毒物和肝脏局部缺血而导致的以肝细胞大量坏死为主要特征的急性肝功能障碍[12]。ALI是多种严重肝病(如肝硬化、肝癌等)的诱因,严重或持续的损伤最终可导致肝衰竭[13]。据估计在世界范围内,每100万ALI患者中有8位患者会最终导致肝衰竭,其发病率和死亡率逐年升高,给家庭和社会带来了沉重的负担[14]。本研究借助高通量、高灵敏度、高分辨率的气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析手段,利用代谢组学方法,研究筛选龙胆泻肝汤对ALI的治疗作用并探寻其代谢组学机制,为开发龙胆泻肝汤的新用途提供相关数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 SPF级SD大鼠,体质量为 200~240 g,雄性,购自吉林大学白求恩医学院动物试验中心,试验许可证号:SCXK(吉)2016-0002。

1.1.2 药物与试剂 龙胆草、黄芩、山栀子、生地黄、泽泻、车前子、当归、木通、柴胡、甘草,购自北京同仁堂药店;以6 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 12 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 8 ∶ 20 ∶ 16 ∶ 6比例配伍(共784 g),5倍水量煎煮3次,每次2 h,合并滤液,浓缩至480 mL(即相当于3 mg/mL生药量的药液)备用。N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS),购自上海麦克林公司;乙腈,色谱纯,购自美国Fisher公司;吡啶、二十二烷、正庚烷、四氯化碳(CCl4)均为分析纯,购自北京化学试剂厂;谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒,购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.1.3 主要仪器 Chemray 24型全自动生化分析仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司;GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪(配备EI离子源,AOC-20i自动进样器),日本岛津公司;HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;H2050R型低温高速冷冻离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机,宁波新芝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组、造模及给药 30只SD大鼠,适应性饲养7 d后,随机分为3组:空白对照组,模型对照组、龙胆泻肝汤组。空白对照组、模型对照组给予水,龙胆泻肝汤组给予10 mL/kg的龙胆泻肝汤药液(即相当于30 mg/kg生药量),连续灌胃给药 7 d,末次给药后6 h,除空白对照组给予花生油 2 mL/kg 腹腔注射外,模型对照组、龙胆泻肝汤组按2 mL/kg腹腔注射50% CCl4花生油(V/V)1次,建立ALI模型。造模后24 h,腹主动脉取血,分离血清,取肝脏部分进行组织病理学检查,部分-80 ℃保存。

1.2.2 血清肝功能指标的测定 以全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平。

1.2.3 肝组织样品前处理 取适量(约1.0 g)肝脏加2倍重生理盐水,以电动玻璃匀浆机研磨制成匀浆,放置于4 mL离心管中于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,移取上清液100 μL于1.5 mL离心管中,加入250 μL乙腈,混悬3 min,冰浴超声10 min,于 4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,吸取上清液200 μL于1.5 mL离心管中冷冻干燥。冷冻干燥后,加入 50 μL 衍生化试剂[V(BSTFA) ∶ V(TMCS)=99 ∶ 1]和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反应0.5 h,1 h后加含0.10 g/L二十二烷的正庚烷150 μL,混匀后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,移取上清液到 1.5 mL 离心管,用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS条件 参考文献方法[15-16]设置GC-MS条件如下:进样口温度:280 ℃;分流比为10 ∶ 1;载气:He;流速:1.88 mL/min;柱温程序:起始温度60 ℃,保持3 min后,以4 ℃/min的速度升温,升温到290 ℃,290 ℃保持10 min。进样量:0.2 μL。离子源和接口温度分别为200 ℃和 300 ℃;电子能量:0.85 eV;溶剂延迟:5.5 min;全扫描模式,扫描范围35~600 m/z。

1.3 数据处理与分析

GC-MS工作站自动获取总离子流(TIC)图和离子片段谱。采用XCMS Online对得到的TIC图进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作,采用SIMCA-P 13.0进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(O-PLS-DA)。筛选出 VIP>1且P<0.05的数据,利用NIST数据库、METLIN数据库、HMDB数据库进行标志物鉴定。利用MetaboAnalyst进行热图分析和代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 龙胆泻肝汤对ALI大鼠血清ALT、AST和ALP的影响

从表1可以看出,与空白对照组比较,模型對照组血清ALT、AST和ALP水平极显著升高(P<001);与模型对照组比较,龙胆泻肝汤能显著降低ALI血清中的ALT、AST和ALP水平(P<0.05),表明经龙胆泻肝汤治疗后ALI损伤有所减轻。

2.2 龙胆泻肝汤对ALI大鼠肝脏组织病理学的影响

从图1可以看出,空白对照组大鼠肝脏组织未见任何异常;模型对照组肝脏组织肝小叶结构紊乱不清,肝细胞明显变性及气球样变性,小区出现多量炎细胞浸润,汇管区大量炎细胞浸润及明显纤维结缔组织增生;经龙胆泻肝汤治疗后肝细胞坏死情况有明显改善,部分区域存在肝细胞稍有轻微水肿,但大部分肝细胞结构正常,偶见气球样变。

2.3 龙胆泻肝汤治疗ALI大鼠的代谢组学机制

2.3.1 代谢轮廓分析 通过XCMS Online软件构建完整的TIC(图2)。采用SIMCA-P 13.0对肝匀浆代谢物进行PCA分析,由PCA(图3)可以看出,空白对照组,模型对照组、龙胆泻肝汤组能够分开并且呈明显的聚类特征。空白对照组样本主要聚集在PCA图的下方,模型对照组样本主要聚集在PCA图的上方,给予龙胆泻肝汤治疗后,样本点的分布逐渐向下方移动,与模型对照组分离且有向空白对照组趋近的趋势。

2.3.2 标志物的鉴定 分别对空白对照组、模型对照组龙胆泻肝汤组和模型对照组进行O-PLS-DA分析,得出O-PLS-DA、S-plot(图4)。S-plot图远离原点,VIP>1.0且P<0.05的代谢物被认为是潜在的生物标志物。经过筛选鉴定最终确定了8种化合物为生物标志物(表2),分别为丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-别苏氨酸、4-羟基脯氨酸、柠檬酸和吲哚乳酸。其中与空白对照组比较,模型对照组中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-别苏氨酸和柠檬酸含量下降(P<0.05),肌氨酸、4-羟基脯氨酸和吲哚乳酸含量升高(P<0.05),而龙胆泻肝汤组中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-别苏氨酸和柠檬酸含量较模型组有显著升高(P<0.05),肌氨酸、4-羟基脯氨酸和吲哚乳酸含量降低(P<0.05)。

2.3.3 热图分析 利用MetaboAnalyst生成可视化热图以概述空白对照组、模型对照组和龙胆泻肝汤组生物标志物的强度情况。从图5可以看出,每列表示空白对照组、模型对照组和龙胆泻肝汤组,增加的表达式值从绿色到红色编码。从热图中可以看出龙胆泻肝汤组中生物标志物有向空白对照组转移的趋势。

2.3.4 代谢通路分析 通过数据库的匹配和相关文献的查阅,利用MetaboAnalyst对鉴定的8种生物标志物进行相代谢通路分析(表3)。选取影响因子(pathway impact)>0.05的代谢通路为主要的影响通路,即三羧酸(TCA)循环,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙酮酸代谢和糖酵解或糖异生5个代谢途径是与ALI的最相关代谢途径(图6)。

3 结论与讨论

CCl4在体内经肝脏的细胞色素P450酶系统可生物转化成大量的活性氧自由基,进而引起细胞膜的脂质过氧化[17]。ALT和AST是存在于肝细胞内的2种转氨酶,一旦肝细胞膜发生脂质过氧化,肝细胞膜损伤,ALT和AST就会释放入血[18]。因此,血液中ALT和AST水平异常升高是ALI的特征标志[19]。此外,ALP也是与ALI密不可分的判断指标[20]。经龙胆泻肝汤治疗后,ALI大鼠ALT、AST和ALP水平明显降低,表明龙胆泻肝汤有明显的治疗ALI的作用。

CCl4引起的ALI可以导致肝脏线粒体的氧化损伤[21]。据相关研究,线粒体是肝脏能量代谢的主要场所,氧化损伤状态下,线粒体能量代谢受阻[22]。丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和柠檬酸均参与丙酮酸代谢、TCA循环和糖酵解途径。与空白对照组比较,模型对照组丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和柠檬酸水平均降低,表明ALI状态下,丙酮酸代谢、TCA循环和糖酵解途径介导的能量代谢受阻。与模型对照组比较,龙胆泻肝汤组丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和柠檬酸水平上升,表明龙胆泻肝汤通过调节丙酮酸代谢、TCA循环和糖酵解途径可以改善ALI能量代谢异常。

乙醛酸和二羧酸代谢与体内的氧化反应有关,扰动此代谢可间接导致TCA循环异常[23]。柠檬酸是乙醛酸和二羧酸代谢与TCA循环的共同产物,模型对照组柠檬酸水平降低,表明经CCl4刺激后,模型对照组大鼠出现了乙醛酸和二羧酸代谢的异常。龙胆泻肝汤可通过升高柠檬酸水平,调节此代谢通路而发挥保肝作用。

甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢与氧化损伤引起的炎症密切关系[24]。炎症导致细胞氧化损伤加剧,进而引起机体对甘氨酸、色氨酸代谢的水平异常[25]。肌氨酸和L-别苏氨酸属于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,与空白对照组比较,模型对照组甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢异常升高,表明在ALI状态下,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢异常。经龙胆泻肝汤治疗后,肌氨酸和L-别苏氨酸降低,表明龙胆泻肝汤还可以通过调节抗甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢水平改善机体的氧化损伤,发挥保肝作用。

综上所述,龙胆泻肝汤有明显的治疗ALI作用,其机制与影响TCA循环,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙酮酸代谢和糖酵解或糖异生等通路有关。

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