卢 静 张 环

(重庆登康口腔护理用品股份有限公司,重庆 400025)

临床上常用广谱抗菌剂如洗必泰、四环素等防龋，但长期使用易引起口腔菌群失调、使细菌产生耐药性，因此近年来寻找天然防龋药物已成为国内外研究热点。蜂胶是蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂，再混以蜜蜂的舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质。在国外，蜂胶被誉为“紫色黄金”。蜂胶是一种具有抗微生物作用的天然抗菌剂，对细菌、真菌都有一定的抑制作用[1-2]。

超临界二氧化碳萃取是一种新型的萃取分离技术。该技术是利用CO2在临界点附近某一区域(超临界区)内，有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。然后借助调整温度和压力的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的。用这种方法得到的蜂胶超临界提取物无毒、无残留、安全，萃取条件室温、无氧，避免有效成分高温分解和氧化，抗菌成分最大程度保留。

本研究通过体外抗菌实验，评估添加了蜂胶超临界提取物的牙膏对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、变异链球菌(ATCC25175)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)这三种常见口腔致病菌的抗菌功效。

1 材料和仪器

仪器：超净台(上海博讯生化设备有限公司)、水套式二氧化碳培养箱(上海三腾仪器有限公司)。

试剂：蜂胶超临界提取物(东莞波顿香料有限公司)；营养琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司)。

2 含蜂胶超临界提取物的牙膏的抗菌活性研究

2.1 金黄色葡萄球菌抑菌活性

从-80℃冰箱中取出保存的菌种，从中挑取适量菌落置于营养琼脂培养基中，37℃下培养36h活化，然后取适量菌液于平板中涂布，37℃下培养24-36h；

将受试菌种分别接种到相应培养基中，待菌种进行活化后，用已灭菌移液枪枪头吸取1ml已活化的待测菌种，置于已灭菌的9mL生理盐水试管中，充分均匀数次，制成菌悬液。然后用已灭菌移液枪枪头吸取1mL上述菌悬液置于另一只装有已灭菌9mL生理盐水试管中进行稀释，依次稀释成107CFU/ml的菌悬液(约10倍稀释5次)，备用。

将编号为A(0.1%蜂胶牙膏)、B(0.3%蜂胶牙膏)、C(空白牙膏)的样品牙膏分别与水按20%(1∶5)，10%(1∶10)，5%(1∶20)的比例稀释成牙膏浆，每个样品稀释三个浓度，共9种牙膏浆浓度。采用牛津杯抑菌法测定金黄色葡萄球菌在加入牙膏浆后的抑菌活性，抑菌圈直径大小作为加入样品后的活性指标。将灭菌处理后的培养基分别倒入无菌平板中，每个平板约15ml，待平板凝固后，用移液枪取200μL菌悬液分别加在平板上，用涂布棒均匀涂开。每个平板放入3个已灭菌的牛津杯，成等边三角形摆放，其中2个牛津杯盛放同一浓度的牙膏浆，1只盛放水溶液作空白对照。然后用已灭菌移液枪枪头分别吸取200μL上述不同浓度的9种牙膏浆和水溶液置于同一平板的3只牛津杯内，每种浓度的样品液做两组平行试验，共18个平板，在37℃下培养36h观察结果。

表1 样品牙膏的平均抑菌圈大小(单位cm)

用十字交叉法测量每个平板中的抑菌圈直径，样品牙膏在20%，10%，5%的稀释比例下，除C样品牙膏无抑菌圈出现外，其它样品均有明显的抑菌圈出现。A、B样品牙膏对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好但无明显差异。

2. 2 变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌抑菌活性[3-4]

从-80℃冰箱中取出保存的菌种，挑取适量菌落置于平板上，37℃下培养36h，然后进行传代和种子培养。用接种环挑取适量菌种于无菌生理盐水离心管中，充分振摇，稀释成107CFU/ml的菌悬液(约10倍稀释4次)，备用。将A、B、C三个样品牙膏分别与水按40%，20%，10%，5%，2.5%，1.25%的比例稀释成牙膏浆，共18种浓度的牙膏浆，备用。取不同浓度的牙膏浆1ml加入无菌平板中，再在无菌平板中加入9ml营养琼脂培养基，摇匀。配制成比牙膏浆浓度稀释10倍的带样平板(即浓度为4%，2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%)，样品溶剂水为空白对照。用移液枪取100 μL107CFU/ml的菌悬液加在带样平板上，用涂布棒均匀涂开。每个浓度做两组平行，在37℃厌氧培养箱中倒置培养72h，观察供试菌生长情况，完全抑制细菌生长的最低样品浓度为对样品供试菌的最小抑制浓度MIC。

表2 变异链球菌生长菌落计数

样品牙膏C对变异链球菌的抑制效果较差，样品牙膏综合浓度在0.25%和0.12%下，A牙膏和B牙膏对变异链球菌的抑制作用相当。

表3 牙龈卟啉单胞菌生长菌落计数

表4 样品牙膏对变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的最小抑制浓度MIC

样品牙膏C对牙龈卟啉单胞菌的抑制效果较差，样品牙膏浓度在0.25%时， B牙膏对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用优于A牙膏；样品浓度为0.12%时，A牙膏对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用优于B牙膏。

从抑菌实验结果可知，添加了蜂胶的牙膏对常见口腔致病菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、变异链球菌(ATCC25175)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)有明显的抗菌功效，0.1%蜂胶牙膏与0.3%蜂胶牙膏效果没有明显差异，而不添加蜂胶的牙膏则无明显的抑菌效果。

3 讨论

蜂胶是一种相对理想的天然广谱抗菌剂，对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌均有不同程度的抑制作用，并且无毒性[2]。蜂胶抗微生物的作用机制较复杂，可能是由于众多成分共同作用所致。蜂胶超临界提取物采用超临界萃取工艺可以最大程度的保留抗菌成分，添加0.1%就可以达到较好的抗菌效果。早在50年代，国外就应用蜂胶软膏成功地治疗了复发性口疮、口腔糜烂、溃疡等口腔疾病。蜂胶在食品、保健品领域用得比较广泛，但在口腔护理用品领域还未得到很好地推广。因此，如何有效利用蜂胶作为抗菌剂治疗龋齿和牙周炎是未来很有必要去研究的一个热门领域。