李光芒

(陕西省蓝田县普化镇畜牧兽医站, 陕西 蓝田 710505)

流行性腹泻是(porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由流行性腹泻病毒(porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的以严重腹泻、呕吐、脱水为主要临床症状的高度接触性传染病[1]。各年龄段的猪都可感染，断奶仔猪和成年猪常发生一过性腹泻，而7日龄以内的哺乳仔猪发生腹泻并死亡，发病率高达100%,病死率平均为50%，且多数疫情发生在中小规模养猪场[2]。此外，该病具有季节性发病特点，我国流行性腹泻多发于寒冷季节，以12月至次年2月为该病的高发期[3]。引起仔猪腹泻的病因有很多，其中猪流行性腹泻病毒(PEDV)，除细菌性腹泻之外，猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病(PRoV)是较为常见的，可以引起仔猪腹泻，而猪德尔塔冠状病毒也是近期发现可以导致仔猪腹泻的新型冠状病毒[4]。在我国猪病毒性腹泻中，PEDV 的感染最为严重[5]。 PEDV 感染仔猪后可导致病猪出现呕吐、水样腹泻、消瘦等临床症状，且伴发高死亡率[6～7]。但由于其临床症状与其它病毒性腹泻类似，临床和病理变化诊断无法确诊，需要借助实验室诊断技术对病因进行确诊，以进行针对性地治疗和防控。

仔猪一旦爆发腹泻，引起仔猪成活率大大下降，生长缓慢，饲料报酬降低外，医药费用的投入也不断增加。对此，细化规模化猪场的饲养管理，有效及时预防产房仔猪腹泻疾病是规模化猪场节约成本，提高效益的方法。笔者就陕西某规模化猪场2019年11月14日产房仔猪发生腹泻的问题，将该场流行病调查、病理变化及实验室的分子诊断结果相结合，最终确诊为变异株感染的流行性腹泻。经过紧急处理措施后，疫情得到了控制，现将疾病的治疗方案和临床措施做一报道，以期为猪场流行性腹泻的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

分别于2019年11月15日陕西省某规模化猪场采集发生腹泻、濒临死亡仔猪的小肠组织及内容物，猪场采集分别采集小肠组织8份，粪便4份。

1.2 试剂与仪器

(1)试剂:核酸提取或淳化试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)；流行性腹泻病毒经典株和变异株双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪轮状病毒实时荧光PCR检测试剂盒、猪传染性胃肠炎病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒均购自湖南圣湘生物科技有限公司。

(2)仪器:旋涡震荡仪(Vorter-5)；高速冷冻离心机(Dlab-D3024R)；干式金属浴锅(上海净信实业发展有限公司，型号：JX-10)；旋涡仪(北京金泰宏达，型号：Mx-F)；超净台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司，型号：CZA1812239)；小型离心机(北京金泰宏达，型号：Spin Plus)；荧光定量PCR仪(MYGo-PRO)；磁力架(24孔)。

1.3 病料处理

取500 mg的样品进行反复冻融3次，且加入1 mL的灭菌生理盐水于组织研磨器中充分研磨后置已高压灭菌的1.5 mL的无酶EP管中，2 500 rpm·min-1离心5 min，将上清转移至一个新的离心管中；粪便取1 g，加入1 mL生理盐水，旋涡震荡15 s，2 500 rpm·min-1离心5 min，将上清(靠近沉淀的上清)转移至新的无酶离心管，-20℃储存备用。

1.4 荧光定量PCR检测

(1)病毒RNA提取。取200 μL样品上清于一个新RNA-free EP管，加入600 μL提取液1，旋涡震荡10 s，在干式金属浴锅上95℃加热10 min，瞬时离心。在每个样品管添加100 μL提取液2和50 μL磁珠溶液，旋涡震荡10 s，室温静置20 min。将样品管瞬时离心后置于磁力架上，3 min后用移液器将溶液吸出(注意枪头不能碰磁力侧的磁珠)。每个样品管加入600 μL提取溶液3和200 μL提取溶液4，震荡混匀5 s，瞬离后将离心管再次置于磁力架上。约3 min后，用移液器将溶液缓慢吸出丢弃，静置1 min后将管底残余液体完全吸出丢弃。用30 μL洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置10 min后将离心管再次置于磁性分离器上3 min，最后将洗脱下来的核酸放于新的1.5 mL离心管中。

(2)qPCR扩增。扩增体系体系为50 μL。反应条件为：反转录50℃30 min，预变性95℃ 1 min；95℃变性15 s，退火延伸60℃30 s，共40个循环；

反应体系组分体系

RNA模板 5μL

PEDV酶混合液2μL

PEDV-反应液 43μL

2 结果

2.1 流行病学调查

2019年11月14日，陕西省某基础母猪存栏数约为1 200头的规模化猪场发生仔猪腹泻，11月14日，产房2日龄个别仔猪出现腹泻症状：呕吐、扎堆、脱水并有严重浆糊样腹泻，11月15日产房7头3日龄仔猪脱水、消瘦严重并死亡，且发病圈舍有个别母猪也出现拉稀现象。11月17日疫情蔓延至妊娠舍、空怀舍及公猪舍。该猪场技术人员发现病情后立即采取隔离、消毒、治疗措施，直到该疫情解除，本次疫情一个月内共死亡仔猪369头仔猪。其中3日龄以内出现腹泻的有26窝，小计286头乳猪，全部死亡淘汰；4～7日龄出现腹泻有12窝，死亡75头乳猪，死亡率63%；8～15日龄出现腹泻症状的有57头仔猪，其中8头死亡，死亡率为14%；出现腹泻症状的母猪及公猪经过治疗一周后恢复正常。

2.2 临床症状及病理变化

(1)临床症状。产房发病的乳猪表现症状为皮肤苍白、被毛逆立、精神委顿、呕吐、腹泻、全身发抖、消瘦，发病初期粪便呈黄色水样或糊状，最后脱水、衰竭死亡(如图1所示)。发病仔猪中个别表现神经症状，口吐白沫，角弓反张，四肢划动呈游泳状。死亡仔猪主要集中在5日龄以内，而且初产母猪所产乳猪发病率较高。

(2)病理变化。发病乳猪表现精神沉郁，消瘦，皮肤黏膜苍白，被毛粗乱，皮肤脱水；吮乳量减少，呕吐、口吐白沫，排出水样粪便，粪便呈黄色水样或糊状；部分乳猪四肢划动呈游泳状。病死猪尸体消瘦，皮肤干燥，呈典型脱水症状(图1)；病理剖检可见脾脏肉眼可见的病理变化，肺脏形成典型间质性肺炎，肾脏表面有较明显的淤血斑；胃容积增大、充满内容物，肠壁变薄，肠内充满黄色液体，胃肠道有豆花样内容物(图2))；肠系膜充血。哺乳仔猪胃内可见黄白色凝乳块，小肠膨胀，肠壁变薄，肠腔内充满黄色稀薄的内容物，肠系膜充血，肠系膜淋巴结肿胀，切面湿润多汁。

2.3 荧光定量PCR检测

猪场荧光定量PCR检测结果:对2019年11月14日从某规模化猪场采集的发病仔猪小肠组织8份及粪便4份，全部用于荧光定量PCR检测，试验结果如图3、4、5显示。被检的12份样品中一份为PEDV疫苗株阳性，其余11份均为PEDV变异株阳性。

结果判断标准：Fam通道Ct值≦40且扩增曲线为典型S型，Hex通道无Ct值或典型的S型扩增曲线，报告为PEDV变异株阳性；Fam通道Ct值≦40，且均有S型扩增曲线，报告为PEDV经典株阳性；Fam通道和Hex通道均无Ct值和S型标准曲线，报告为PEDV经典株和疫苗株阴性。

根据上述实验室荧光定量PCR检测结果并结合流行病学调查，临床症状，病理变化分析，该猪场在2019年11月仔猪发生腹泻性疾病的发生原因，确诊为猪流行性腹泻。

3 讨论

1978 年，比利时首次分离鉴定出该病毒，命名为 CV777[8]。随后，匈牙利、德国、泰国、韩国、日本、中国、美国等国家都陆续报道了本病。PEDV 造成的危害非常严重，2010-2011 年，我国有 100 多万头猪死于 PEDV[9]，2013 年美国暴发PEDV疫情，当年美国损失了700 万头仔猪[10]。给养猪业带来了巨大的经济损失。

笔者研究通过对某规模化猪场腹泻仔猪进行流行病学调查，临床症状、病理变化观察以及实验室荧光定量qPCR检测的结果，将该猪场在2019年11月仔猪发生腹泻性疾病的原因，确诊为猪流行性腹泻。

该猪场在发生仔猪腹泻性疾病时，存在以下问题：①环境因素：产房卫生条件差，保温措施不理想，昼夜温差大，加之入冬的突然降温导致长期应激仔猪的发病。②管理因素：该猪场仔猪发病前期有产房饲养员窜舍借用后备舍电源的情况，后备舍母猪之前存在拉稀现象，该行为应该是仔猪腹泻发生的直接诱因。③出生仔猪未能及时补充铁硒等微量元素，导致仔猪抵抗力差，免疫系统脆弱。④生物防治因素：没有做到全群免疫，所用疫苗质量不好。

根据该规模化猪场存在的问题，提出以下几点紧急处理措施。发病产房所有人员进行隔离，并且严禁其他产房人员靠近发病产房；母猪普免2头份腹泻疫苗(后海穴注射)；腹泻仔猪灌服5 mL硫酸庆大，并肌肉注射恩诺沙星2 mL；对产床下面及下水道抛洒火碱进行消毒，产床及保温箱内铺洒密斯陀粉，并封闭下水道出口防止扩散；对脱水仔猪进行补液；对死亡仔猪进行采样检测；对伤亡严重的圈舍生火炉提高圈舍内温度。

母猪全群普免腹泻苗，2周后执行跟胎免疫方案，产前30 d活疫苗1头份(后海穴注射)，产前10 d灭活苗4 mL(后海穴注射)；仔猪7日龄1头份(活苗)后海穴注射，通过对比试验进行效果评价；初生仔猪：吃初乳前，仔猪灌服1头份活疫苗+2 mL腹泻专用稀释液+3 mL纯牛奶，灌服2 min后吃初乳。通过对比试验进行效果评价。此规模化猪场在实施以上几点防控措施20 d之后，仔猪腹泻性疾病的发病率显著下降，而且发生腹泻的仔猪治愈率有所升高。