问清江， 慕 娟，郑巧霞，孙晓宇，丁 浩

( 陕西省微生物研究所， 陕西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)是主要由α-(1,6)糖苷键连接而成的葡聚糖，是肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)产生的胞外多糖[1]。右旋糖酐因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域[2]。医药的主要用途为血浆代用品，其具有具有增加血容量、改善微循环、防止弥散性血管内凝血的作用，主要用于治疗失血性休克，临床上应用的常有3种规格产品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20[3～5]。药用右旋糖酐的传统生产为，蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵转化而成分子量巨大的右旋糖酐，经盐酸水解为一定分子量分布的低分子右旋糖酐，分离纯化为目标右旋糖酐。右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)能够催化水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷键，降解为小分子的右旋糖酐、异麦芽糖、异麦芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶水解右旋糖酐，具有专一性和高效性，可以提高水解效率；酶的底物特异性显示酶的亲和力随底物分子量的增加而增强，尤其是对分子量1 000万以上的右旋糖酐的亲和力远远大于100万以下的右旋糖酐，这一特点有益于改善水解物的分子量分布[6]；水解反应条件温和，既可避免盐酸水解设备的特殊要求，又可以降低能耗。总之将右旋糖酐酶酶解右旋糖酐用于右旋糖酐原料药的生产，可以提高产率、改善产品品质。在先期右旋糖酐酶酶学性质研究基础之上进一步进行酶解条件研究，通过酶浓度、右旋糖酐浓度、温度、时间等酶解条件及酶解液后处理等工艺条件研究，以利于改进右旋糖酐原料药生产技术和提升产品品质。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)右旋糖酐酶(宁夏夏圣实业集团有限公司)。

(2)试剂：葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司产品；蔗糖(AR)，3,5-二硝基水杨酸(CP)；其他试剂为市售分析纯。

(3) 粗酐(陕西省微生物研究所自制)。

(4)仪器。722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)； 2010A-HT高效液相色谱仪(苏州贝锐仪器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐酶浓度对右旋糖酐酶解的影响 分别以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 IU·mL-1不同酶浓度，在温度50℃，时间2.5 h，粗酐浓度6%条件下酶解右旋糖酐。间隔30 min取样测定葡萄糖含量及分子量分布，水解结束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干为干品，干品测定分子量分布。

1.2.2 pH对右旋糖酐酶解的影响 分别在pH4.0、4.6、5.0、5.4、6.0不同pH条件下酶解右旋糖酐，温度50℃，酶浓度0.3 IU·mL-1，时间2.5 h，粗酐浓度6%。间隔30 min取样测定葡萄糖含量及分子量分布，水解结束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干为干品，干品测定分子量分布。

1.2.3 右旋糖酐浓度对右旋糖酐酶解的影响 选取右旋糖酐浓度为4%、5%、6%、7%、8%，在酶浓度0.3 IU·mL-1，pH5.0，温度50℃，时间2.5 h条件下进行酶解。间隔30 min取样测定葡萄糖含量及分子量分布，水解结束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干为干品，干品测定分子量分布。

1.2.4 温度对右旋糖酐酶解的影响 分别在40、45、5.0、55、60℃不同温度下酶解右旋糖酐，酶浓度0.3 IU·mL-1，pH5.0，温度50℃，时间2.5 h，粗酐浓度6%。间隔30 min取样测定葡萄糖含量及分子量分布，水解结束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干为干品，干品测定分子量分布。

1.2.5 还原糖测定(以葡萄糖糖计)[7]采用DNS法测定葡萄糖糖。葡萄糖糖标准曲线绘制：配制1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，分别量取0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水补齐1.0 mL，再加入2.0 mLDNS，沸水浴2 min，冷水浴水冷却后加蒸馏水至10 mL，在540 nm进行光吸收测定，绘制葡萄糖糖标准曲线，得出回归方程用于葡萄糖的测定。

酶解液等样品稀释一定倍数，取样品1.0 mL加入2.0 mL DNS煮沸2 min显色，然后冷水浴冷却至室温，定容至10.0 mL，以蒸馏水为对照，540 nm测定吸光值，根据回归方程得出样品中的葡萄糖糖含量。

葡萄糖糖含量算公式：

葡萄糖(mg·mL-1)=[(Ae-A0) + 0.1182]/1.614×Df

式中：Ae——样品的吸光值

A0—蒸馏水空白的吸光值

Df—样品的稀释倍数

1.2.6 分子量与分子量分布[8]取样品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜作为供试品溶液。另取4～5个已知分子量的右旋糖酐对照品，依法检查(2015版《药典》二部附录VH)，样品10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 结果与分析

2.1 右旋糖酐酶浓度对右旋糖酐酶解的影响

不同右旋糖酐酶浓度下右旋糖酐水解过程中的还原糖和重均分子量变化及酶解结果见图2～图5。各种酶浓度下的还原糖随时间的增加而增大，在同一时间点还原糖和还原糖增加趋势随酶浓度的增加而增大，原因在于，打开糖苷键就会产生还原端，酶浓度越高酶解效率越高，产生的还原端越多。酶解进程中重均分子量总体呈现出逐渐降低的趋势，0.1 IU·mL-1酶浓度和其余酶浓度的重均分子量变化趋势略有不同，前者在初始时段降低较慢，后者在初始阶段降低较快，这是酶解液中酶量的大小所致。不同酶浓度下的酶解产物的重均分子量随酶浓度的增加而降低，0.1 IU·mL-1酶浓度产物的重均分子量在10 000以上，其余均低于10 000。

2.2 pH对右旋糖酐酶解的影响

在不同pH条件下酶解右旋糖酐， pH4.6、pH5.0和pH5.4的还原糖随着酶解时间的延长呈现明显的上升趋势，而pH4.0和pH6.0的还原糖变化呈现水平状态(见图6)。原因在于该右旋糖酐酶的最适反应pH值是pH5.0[6]，pH4.6和pH5.4接近pH5.0，对右旋糖酐的酶解影响不大，pH5.0的酶解最好，其次是pH4.6和pH5.4；而pH4.0和pH6.0远离pH5.0，酶解效果很差。在不同pH下右旋糖酐酶解进程中重均分子量变化趋势呈现降低趋势(见图7～图8)，降低的幅度和还原糖增加的幅度一致。不同pH的右旋糖酐酶解结果见图9，pH4.0和pH6.0的重均分子量在200 000以上，pH4.6、pH5.0和pH5.4的重均分子量在10 000以下，pH5.0的最低。根据以上结果，右旋糖酐酶解的pH为pH4.6～5.4，pH5.0最佳。

2.3 右旋糖酐浓度对右旋糖酐酶解的影响

在其他酶解条件相同的情况下，不同浓度右旋糖酐酶解进程中的还原糖和重均分子量变化及酶解结果见图10～图12。还原糖随时间的变化均呈现增加趋势，同一时间点，还原糖基本随右旋糖酐浓度的增加而增加。重均分子量均随酶解时间的延长呈下降趋势，同一时间点重均分子量随右旋糖酐浓度的增加而下降。水解产物的重均分子量随右旋糖酐浓度的增加而增加，4.0%～7.0%增幅相近，8.0%比7.0%增加幅度较大。在右旋糖酐酶解时，底物浓度的可选择择范围较广。

2.4 温度对右旋糖酐酶解的影响

不同温度条件下酶解右旋糖酐，还原糖和重均分子量随时间变化及酶解结果见图13～图16。45℃、50℃、55℃还原糖随时间的变化趋势基本一致，呈现上升趋势；40℃也呈现上升趋势，只是增加的趋缓；60℃基本是一条水平线，还原糖随时间变化甚微。重均分子量的变化表现为45℃、50℃、55℃呈现相似的下降趋势，40℃下降趋缓，60℃基本水平。酶解结果表明，40℃的产物重均分子量为10 000以上，45℃、50℃、55℃的在5 000～7 000，60℃的在200 000以上。该右旋糖酐酶的最适作用温度为55℃，50℃以下相对稳定[6]，40℃酶解右旋糖酐发硬速率较低，45～55℃之间反应速率快，60℃酶失活，这些就是造成以上结果的主要原因。在选择右旋糖酐酶解温度时，既要考虑反应速率，也要考虑酶的热稳定性，所以将酶解温度定于45～55℃，最好在50℃。

2.5 右旋糖酐酶解制备右旋糖酐40

右旋糖酐酶水解右旋糖酐制备右旋糖酐40，产品的分子量分布均已达到中国药典右旋糖酐40产品标准，重均分子量35 000以上，10%小分子大于7 000，二者均已已提高到BP2012(EPS)标准[9]，大大提升了了产品质量，产品收率最高可达35%以上。

表1 右旋糖酐40制备结果

3 讨论

右旋糖酐酶浓度为0.1 IU·mL-1时，酶解产物的重均分子量在10 000以上，因此运用该右旋糖酐酶酶解制备医用右旋糖酐时，酶浓度应该选择在0.1 IU·mL-1以下。该酶最适反应pH值是pH5.0[6]，pH4.6和pH5.4接近pH5.0，对右旋糖酐的酶解影响不大，pH5.0的酶解最好，其次是pH4.6和pH5.4；而pH4.0和pH6.0远离pH5.0，酶解效果很差，右旋糖酐酶解的pH为pH4.6～5.4，pH5.0最佳。水解产物的重均分子量随右旋糖酐浓度的增加而增加，4.0%～7.0%增幅相近，8.0%比7.0%增加幅度较大，在右旋糖酐酶解时，底物浓度的可选择择范围较广。该右旋糖酐酶的最适作用温度为55℃，50℃以下相对稳定[6]，40℃酶解右旋糖酐发硬速率较低，45～55℃之间反应速率快，60℃酶失活，在选择右旋糖酐酶解温度时，既要考虑反应速率，也要考虑酶的热稳定性，所以将酶解温度定于45～55℃，最好在50℃。在应用右旋糖酐酶酶解右旋糖酐时，既要考虑以上几个因素，还要和具体标的物的分子量分布要求、右旋糖酐的状态(发酵液，乙醇提取粗酐，膜分离粗酐。)等因素相结合，进一步选择合适的酶浓度、温度、底物浓度、pH值、酶解时间等条件。右旋糖酐酶水解右旋糖酐制备右旋糖酐40，产品的分子量分布均已达到中国药典右旋糖酐40产品标准，重均分子量35 000以上，10%小分子大于7 000，二者均已提高到BP2012(EPS)标准[9]，大大提升了产品质量，产品收率最高可达35%以上。以右旋糖酐酶酶解右旋糖酐代替盐酸水解，优化水解工艺，提升产品品质，提高生产效率，降低企业环保负荷。右旋糖酐酶解条件的研究只是一个初步探索，要用右旋糖酐酶酶解右旋糖酐代替盐酸水解制备右旋糖酐40等医用右旋糖酐实现产业化，还需要进一步的工艺条件研究。